Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,118

COMPARATIVE ANTIOXIDANT ACTIVITY OF SELENOORGANIC COMPOUND DIACETOPHENONYLSELENID AND IT NITRODERIVATIVE IN ORGANS AND TISSUES OF MICE WITH VARIOUS OXIDORESISTANCE

Rusetskaya N.Y. 1 Borodulin V.B. 1 Sarattsev A.V. 2 Borodulin Y.V. 1
1 Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky
2 First Moscow State Medical University n.a. I.M. Sechenov
Исследовалась антиоксидантная активность селеноорганического соединения диацетофенонилселенид – ДАФС-25 (соединение 1) и его нитропроизводного (соединение 2) в органах и тканях мышей с низкой оксидорезистентностью (легкие, почки и мозг) и с высокой оксидорезистентностью (эритроциты, печень и плазма). Соединение 1 оказывало значительное антиоксидантное действие, которое выражалось в снижении содержания малонового диальдегида и увеличении активности антиоксидантных ферментов каталазы, супероксиддисмутазы и глутионпероксидазы во всех исследованных органах и крови. Соединение 2 (нитропроизводное ДАФС-25) значительно снижало реакции перекисного окисления липидов в мозге, легких, эритроцитах и плазме. Достоверное снижение концентрации диеновых конъюгатов под действием соединения 1 отмечалось лишь в гомогенатах легких и в случае соединения 2 – в гомогенатах мозга. Предполагается, что выраженная антиоксидантная активность соединений 1 и 2 обусловлена освобождением атома селена из соединений и включением его в активный центр глутионпероксидазы.
Antioxidant activity of selenoorganic compound Diacetophenonylselenid (DAPS-25 – compound 1) and it nitroderivative (compound 2) in organs and tissues of mice (blood plasma, erythrocytes, liver, lungs, kidneys and brain) was investigated. Compound 1 had considerable antioxidant action which was expressed in maintenance decrease of malone dialdehide and increase of antioxidant enzymes activity (catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase) in all investigated tissues and blood. Compound 2 (nitroderivative of DAPS-25) considerably reduced reactions of lipid peroxidation in a brain, lungs, erythrocytes and plasma. Authentic decrease in concentration of diene conjugates under action of compound 1 was marked only in homogenates of lungs and in the case of compound 2 – in homogenates of a brain. It is supposed, that expressed antioxidant activity of compounds 1 and 2 is caused by clearing of atom of selenium from connections and its inclusion in the active site of glutathione peroxidase.
DAPS
selenoorganic compounds
antioxidant activity
oxidoresistance
1. Bessonova L.O., Verlan N.V., Kolesnichenko L.S. Sibirskiymedicinskiyjurnal – The Siberian medical magazine, 2008, no.6, pp. 19–21.
2. Glantz S. Mediko-biologicheskaja statistica [Primer of biostatistics]. Transfer from English Y.A. Danilov; under the editorship of N.E.Buzikashvili, D.V.Samoilov. Мoscow, Practice, 1998. 459 p.
3. Gmoshinskiy I.V., Mazo V.K. Medicina Altera, 1999, no. 4, pp. 18–22.
4. Dubinina E.E., Salnikova L.A., Yefimova L.F. Lab. delo – Lab. business, 1983, no. 10, pp. 30–33.
5. Kirova Y.I. Antioxidantnoe i antitoxicheskoe deystvie novich selenoorganicheskich soedineniy [Antioxidant and antitoxic action of new selenoorganic compounds]. Rostov-on-Don, 2004. pp. 151–158.
6. Karpischenko A.I. Medicinskiye laboratornie technologii. Spravochnik [Medical laboratory technologies. The directory]. St.-Petersburg, Intermedica, 1999. pp. 27–28.
7. The patent of the Russian Federation № 93045743/15, 10.01.1996. Drevko B.I., Antipov V.A., Zhukov O.I, Fomenko L.A., Markova L.I., Drevko R.I., Rodionova T.N., Efremov V.I., Kharchenko V.G. The Patent of Russia no. 2051681. 1993. Bulletin no.1.
8. Orechovich V.N. Sovremennye methodi v biochimii [Modern methods in biochemistry]. Moscow, Medicine, 1977. pp. 63–64.
9. Orechovich V.N. Sovremennye methodi v biochimii [Modern methods in biochemistry]. Moscow, Medicine, 1977. pp. 66–68.
10. Tyukavkina N.A. Bioorganicheskaya chimiya [Bioorganic chemistry]. Moscow, Drofa, 2004, 544 p.

В настоящее время для профилактики и лечения селенодефицита применяются биологически активные вещества, содержащие неорганический селен, главным образом, селенит натрия [3]. В то же время органические соединения селена по сравнению с неорганическими являются менее токсичными, более биодоступными и лучше усваиваемыми живыми организмами. Поэтому научные разработки последних лет направлены на синтез и использование органических форм селена в целях профилактики селенодефицита и ряда заболеваний (беломышечной болезни, некроза и жирового перерождения печени, экссудативного диатеза, энцефаломаляции, расстройства сперматогенеза и др.).

В животноводстве и в птицеводстве ряда регионов России в настоящее время применяется селеноорганический препарат диацетофенонилселенид (ДАФС-25), который позволяет нормализовать деятельность иммунной, антиоксидантной и детоксицирующей систем организма животных и птиц, приводит к увеличению яичной и мясной продукции. ДАФС-25 в 40 раз менее токсичен селенита натрия, селен в нем находится в органической, более доступной для животных форме [7].

В связи с вышеизложенным целью нашего исследования явилось изучение сравнительной антиоксидантной активности селеноорганического соединения диацетофенонилселенида – ДАФС-25 – 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 (соединение 1) и его нитропроизводного – соединения 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 (соединение 2) в органах мышей с различной оксидорезистентностью.

Материалы и методы исследования

В работе использовали селеноорганическое соединение ДАФС-25 – 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 (соединение 1) и 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 (соединение 2), которые растворяли в растительном масле (рисунок).

pic_12.tif

Соединение 1

pic_13.tif

Соединение 2

Соединение 1 – 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 (ДАФС-25); соединение 2 – 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5

Эксперимент проводили на самцах белых беспородных мышей возрастом 2 месяца и массой 20 г. Каждая группа мышей включала 7 животных. Животным первой группы (контроль) вводили per os растительное масло в количестве 10 мкл. Животным 2-й и 3-й групп вводили per os препараты 1 и 2 соответственно в количестве 10 мкл, с дозой 800 мкг/кг. Эксперимент проводили в течение 14 дней. Все работы с лабораторными мышами проводили согласно принципам гуманного отношения к животным в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003). По окончании эксперимента кровь собирали в пробирку с гепарином. В цельной крови определяли активность фермента глутатионпероксидазы (ГПО) на полуавтоматическом анализаторе «Hospitex Screen master plus» с использованием наборов реактивов фирмы «Randox» (UK). После центрифугирования цельной крови получали плазму и эритроциты. Гомогенаты органов печени, почек, мозга и легких готовили путем гомогенизации с использованием фосфатного буфера. В плазме, гемолизате эритроцитов и гомогенатах органов определяли активность ферментов супероксиддисмутазы (СОД) [4] и каталазы [6], а также содержание диеновых конъюгатов (ДК) [8] и малонового диальдегида (МДА) [9]. Определение проводили на фотоэлектроколориметре КФК-3. Пересчет проводили на 1 г ткани для гомогенатов или на 1 мл для плазмы и эритроцитов.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли на персональном компьютере при помощи программы Microsoft Office Excel. Большинство данных не удовлетворяет закону нормального распределения случайной величины, поэтому для сравнения значений использовали Т-критерий Манна‒Уитни, на основании которого оценивали уровень доверительной вероятности 1 – α (комплементарная ей величина α называется уровнем значимости). Критический уровень доверительной вероятности при проверке статистических гипотез принимали равным 1 – α = 0,95 (критический уровень значимости α = 0,05) [2].

Результаты исследования и их обсуждение

В нашей работе проводилось изучение основных показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме, гемолизате эритроцитов, гомогенатах органов (печени, почек, мозга и легких), а также активности ГПО в цельной крови. Выбранные ткани отличаются по активности антиоксидантной защиты. Согласно литературным данным [5], наиболее активно свободнорадикальное окисление липидов осуществляется в селезенке, сердце, легких, почках и мозге. Относительно низкая активность процессов пероксидации выявлена в эритроцитах, печени и плазме.

Следовательно, мы выбрали три органа с низкой оксидорезистентностью (легкие, почки и мозг) и три – с высокой оксидорезистентностью (эритроциты, печень и плазма). Антиоксидантные показатели интактных мышей, представленные в табл. 1 и 2, подтверждают это. Так, наибольшая концентрация продуктов ПОЛ – ДК и МДА – отмечается в гомогенатах мозга и легких, и наименьшая – в гемолизате эритроцитов и плазме. Однако содержание продуктов ПОЛ в гомогенате печени больше, чем в гомогенате почек. Активность антиоксидантного фермента каталазы максимальна в гемолизате эритроцитов и плазме мышей контрольной группы. Активность каталазы в гомогенатах печени и почек сопоставима. В гомогенатах мозга и легких активность каталазы заметно ниже. Максимальная активность СОД обнаружена в гомогенате легких, поскольку в легких повышена возможность реализации свободнорадикальных реакций. В отличие от других органов, респираторная ткань непосредственно подвергается действию кислорода – инициатора окисления [1]. Также высокая активность СОД отмечается в гомогенатах почек. Активность СОД в оксидорезистентных эритроцитах, плазме и печени сопоставима. Минимальная активность СОД выявлена в гомогенатах мозга интактных животных. Полученные данные демонстрируют высокую оксидорезистентность в эритроцитах и плазме и слабую – в легких и мозге.

Соединение 1 (ДАФС-25) оказывало значительное антиоксидантное действие, т.к. у мышей, принимавших это соединение, отмечалось снижение концентрации МДА (см. табл. 1): в эритроцитах на 49,7 %, в плазме на 41,67 %, в гомогенатах мозга на 41,5 %, легких на 46,9 % и почек на 20,7 % (1 – α > 0,95). Лишь незначительное снижение МДА в гомогенате печени на 13 % оказалось недостоверным. Уменьшение концентрации диеновых конъюгатов (ДК) отмечалось только в гомогенатах легких на 47,6 %.

Антиоксидантное действие соединения 1 также подтверждалось увеличением активности антиоксидантных ферментов. Активность каталазы достоверно увеличивалась в гемолизате эритроцитов на 69,23 %, в гомогенатах мозга на 219,23 % и легких на 236,36 % (1 – α > 0,95). Незначительное увеличение активности каталазы в гомогенатах печени и почек было недостоверным. Активность каталазы в плазме не изменялась по сравнению в контролем.

Таблица 1

Антиоксидантные показатели у мышей, получавших соединение 1 (ДАФС-25)

 

Эритроциты

Плазма

Гомогенаты органов

печень

мозг

легкие

почки

ДК, ммоль/л

Контроль

1,64 (1,57; 1,68)

0,645 (0,636; 0,65)

4,19 (3,87; 4,81)

6,88 (6,73; 7,05)

11,59 (10,96;12,77)

3,35 (3,12; 3,51)

Соединение 1

1,7 (1,68; 1,744)

Т = 51,5

1 – α < 0,95

0,69 (0,66; 0,736)

Т = 43

1 – α < 0,95

4,69 (4,56; 4,8)

Т = 50

1 – α < 0,95

6,63 (6,135; 6,98)

Т = 45

1 – α < 0,95

6,07 (5,69; 6,34)

Т = 28

1 – α > 0,95

4,29 (3,86; 4,69)

Т = 56

1 – α < 0,95

МДА, ммоль/л

Контроль

0,835 (0,785;0,89)

0,084 (0,064; 0,09)

3,36 (3,33;3,38)

7,97 (7,79; 8,14)

3,88 (3,75; 4,02)

2,03 (1,83; 2,29)

Соединение 1

0,42 (0,38; 0,44)

Т = 28

1 – α > 0,95

0,049 (0,042;0,052)

Т = 29

1 – α > 0,95

2,92 (2,63; 3,21)

Т = 40

1 – α < 0,95

4,66 (4,47; 4,86)

Т = 28

1 – α > 0,95

2,06 (1,89; 2,226)

Т = 28

1 – α > 0,95

1,61 (1,52;1,76)

Т = 28

1 – α > 0,95

Каталаза, ммоль/ (мин·л)

Контроль

0,312 (0,3;0,32)

0,13 (0,125; 0,14)

0,04 (0,039; 0,042)

0,026 (0,023; 0,027)

0,011 (0,0097; 0,0123)

0,042 (0,039;0,054)

Соединение 1

0,84 (0,81;0,87)

Т = 77

1 – α > 0,95

0,129 (0,119;0,142)

Т = 57

1 – α < 0,95

0,059 (0,058;0,063)

Т = 56

1 – α < 0,95

0,083 (0,076;0,093)

Т = 77

1 – α > 0,95

0,037 (0,027;0,043)

Т = 77

1 – α > 0,95

0,045 (0,038;0,054)

Т = 58

1 – α < 0,95

СОД, усл. ед.

Контроль

1291,7 (1219; 1398)

1121 (1000; 1225)

1436,2 (1377; 1529)

895,3 (815,0; 982)

3121,7 (2985; 3269)

1806,8 (1735; 1878)

Соединение 1

34116,67

(32350; 35000)

Т = 77

1 – α > 0,95

1642,45

(1594; 1666,7)

Т = 77

1 – α > 0,95

7891,0

(7245,0; 8214,0)

Т = 77

1 – α > 0,95

3290,33

(2919,0; 3476,0)

Т = 77

1 – α > 0,95

4835,57

(4791,33;4857,7)

Т = 77

1 – α > 0,95

3455,56

(3257,67; 3554,5)

Т = 77

1 – α > 0,95

Примечание. Приведены сначала медиана, затем в скобках нижний и верхний квартили.

Обозначения: Т – статистический критерий Манна–Уитни; 1 – α – уровень доверительной вероятности (α – уровень значимости).

Таблица 2

Антиоксидантные показатели у мышей, получавших соединение 2 (нитропроизводное соединения ДАФС-25)

 

Эритроциты

Плазма

Гомогенаты органов

печень

мозг

легкие

почки

ДК, ммоль/л

Контроль

1,64 (1,57; 1,68)

0,645 (0,636; 0,65)

4,19 (3,87; 4,81)

6,88 (6,73; 7,05)

11,59 (10,96;12,77)

3,35 (3,12; 3,51)

Соединение 2

1,74 (1,659; 1,82)

Т = 50

1 – α < 0,95

0,734 (0,732; 0,74)

Т = 48

1 – α < 0,95

4,87 (4,6; 5,125)

Т = 54

1 – α < 0,95

5,21 (4,99; 5,52)

Т = 28

1 – α > 0,95

13,125 (12,96;13,29)

Т533

1 – α < 0,95

4,5 (4,31; 4,69)

Т = 77

1 – α > 0,95

МДА, ммоль/л

Контроль

0,835 (0,785;0,89)

0,084 (0,064; 0,099)

3,36 (3,33;3,38)

7,97 (7,79; 8,14)

3,88 (3,75; 4,02)

2,03 (1,83; 2,29)

Соединение 2

0,306 (0,29; 0,32)

Т = 28

1 – α > 0,95

0,034 (0,032;0,036)

Т = 28

1 – α > 0,95

3,69 (3,26; 4,12)

Т = 50

1 – α < 0,95

4,07 (3,88;4,26)

Т = 28

1 – α > 0,95

3,01 (2,79; 3,23)

Т = 29

1 – α > 0,95

1,735 (1,455;2,015)

Т = 45

1 – α < 0,95

Каталаза, ммоль/ (мин·л)

Контроль

0,312 (0,3;0,32)

0,13 (0,125; 0,14)

0,04 (0,039; 0,042)

0,026 (0,023; 0,027)

0,011 (0,0097; 0,0123)

0,0423 (0,0399;0,054)

Соединение 2

0,97 (0,87;1,00)

Т = 77

1 – α > 0,95

0,32 (0,29;0,34)

Т = 77

1 – α > 0,95

0,168 (0,156;0,18)

Т = 77

1 – α > 0,95

0,043 (0,04;0,046)

Т = 74

1 – α > 0,95

0,053 (0,039;0,063)

Т = 77

1 – α > 0,95

0,065 (0,056;0,076)

Т = 74

1 – α > 0,95

СОД, усл. ед.

Контроль

1291,67 (1219; 1398)

1121 (1000; 1225)

1436,16 (1376,7; 1529,3)

895,33 (815,0; 982)

3121,76 (2985,5; 3269,9)

1806,83 (1734,9; 1878,8)

Соединение 2

18333,33 (17000; 19000)

Т = 77

1 – α > 0,95

2954,67 (2750; 3057)

Т = 74

1 – α > 0,95

3422,86 (3228,89; 3519,85)

Т = 74

1 – α > 0,95

1591,87 (1561,34; 1607,14)

Т = 74

1 – α > 0,95

4511,67 (4161,3; 4687,5)

Т = 74

1 – α > 0,95

3551,67 (3455; 3600)

Т = 77

1 – α > 0,95

Примечание. Приведены сначала медиана, затем в скобках нижний и верхний квартили.

Обозначения: Т – статистический критерий Манна‒Уитни; 1-α – уровень доверительной вероятности (α – уровень значимости).

Таблица 3

Активность глутатионпероксидазы (ГПО) в цельной крови у мышей всех групп

 

Контроль

Соединения

1

2

ГПО, ед/ г Hb

365,31 (350,96; 376,38)

601,47 (560,47; 641,65)

Т = 77

1 – α > 0,95

726,52 (693,3; 760,14)

Т = 77

1 – α > 0,95

Активность СОД значительно возрастала во всех исследованных тканях: в гемолизате эритроцитов в 26,4 раза, в плазме на 46 %, в гомогенатах печени на 449,45 %, мозга на 267,5 %, легких на 54,9 % и почек на 91,25 % (см. табл. 1).

У мышей этой группы активность селенозависимого фермента крови ГПО увеличивалась на 64,6 % по сравнению с контролем (см. табл. 3).

Под действием соединения 2 у экспериментальных животных снижалась концентрация МДА в гемолизате эритроцитов (63,35 %), плазме (59,5 %), гомогенатах мозга (48,9 %) и легких (22,4 %), а также концентрация ДК в гомогенате мозга (24,3 %) (см. табл. 2). Следует отметить лишь незначительное увеличение содержания ДК в гомогенате почек на 34,3 % (1 – α > 0,95) (см. табл. 2).

Антиоксидантное действие соединения 2 также характеризуется увеличением активности ферментов каталазы, СОД и ГПО. Активность каталазы возрастала в гемолизате эритроцитов (на 210 %), плазме (146 %), гомогенатах печени (320 %), мозга (65,4 %), легких (381,8 %) и почек (53,7 %). Активность СОД также значительно возрастала во всех исследованных образцах крови и тканей: в гемолизате эритроцитов (на 1319 %), плазме (163,6 %), гомогенатах печени (138,3 %), мозга (77,8 %), легких (44,5 %) и почек (96,6 %). У мышей, получавших перорально соединение 2, активность селенозависимой ГПО возрастала на 98.9 % по сравнению с контролем (см. табл. 3), что превышало активность ГПО у мышей, получавших соединение 1 (1 – α > 0,95).

Таким образом, антиоксидантное действие соединения 2 сопоставимо с действием соединения 1 (препарат ДАФС-25).

Заключение

Подводя итог полученным результатам, следует отметить, что исследованные селенорганические соединения 1 и 2 наиболее эффективно оказывали антиоксидантное действие на органы мышей с низкой оксидорезистентностью, главным образом, на легкие и мозг. Более слабый антиоксидантный эффект наблюдался в высокооксидорезистентных гемолизате эритроцитов и плазме.

Наименьшая антиоксидантная активность исследованных соединений обнаружена в клетках печени и почек. Подобную неэффективность антиоксидантов в клетках этих органов можно объяснить их участием в метаболизме и экскреции ксенобиотиков. В печени происходит детоксикация гидрофобных веществ, а почки участвуют в их выведении.

Из изученных соединений наибольший антиоксидантный эффект продемонстрировало соединение 1 (ДАФС-25), поскольку при его применении происходило одновременное снижение концентрации продуктов ПОЛ и увеличение активности ферментов каталазы, СОД и ГПО в органах и крови. Высокой антиоксидантной активностью обладало соединение 2 (нитропроизводное ДАФС-25), которое значительно снижало реакции ПОЛ в мозге, легких, эритроцитах и плазме.

Выраженная антиоксидантная активность соединений 1 и 2 обусловлена, как предполагается, освобождением атома селена из соединений и включением его в активный центр главного антиоксидантного фермента ГПО. Освобождение атома селена из соединений 1 и 2 возможно благодаря разрыхлению связей C-Se в их молекулах. Этому способствуют карбонильные группы в составе исследованных соединений, которые обладают отрицательным индуктивным эффектом и способны оттягивать на себя электроны, приводя к разрыхлению связи C-Se и освобождению атома селена из молекулы. Нитрогруппа в составе препарата 2 также способна вызывать разрыхление связи C-Se, т.к. она обладает отрицательным мезомерным эффектом и способна оттягивать на себя электронную плотность в сопряженной системе [10]. Таким образом, в разрыхление связи C-Se соединения 2 вносят вклад как карбонильные группы, так и нитрогруппы, поэтому, как мы предполагаем, атом селена из этого соединения будет освобождаться быстрее, чем из соединения 1, что подтверждается более высокой активностью ГПО при действии соединения 2.

Рецензенты:

Коннова С.А., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биохимии и биофизики ФГБУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского», г. Саратов;

Горошинская И.А., д.б.н., профессор, руководитель биохимической лаборатории ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт», г. Ростов-на Дону.

Работа поступила в редакцию 15.01.2013.