Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

RECOMBINENT PRODUCER OF CHICKEN SOMATOLIBERIN IN BACILLI

Belyakova A.V. 1, 2, 3 Epova E.Y. 3 Gra O.A. 4 Zylkova M.V. 2, 4 Plaksina A.G. 2, 5 Smirnova M.S. 2 Elagina E.M. 6 Filimonova N.A. 2, 7 Khasanova E.R. 5 Smirnova A.V. 5 Kazeeva T.N. 5 Shibaeva A.V. 2, 7 Shevelev A.B. 2 Aleshin V.V. 3, 5
1 Federal Center for Toxicological and Radiation Safety of Animals, Kazan
2 Federal State Budgetary Institution «Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides» of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow region
3 Moscow state academy of veterinary medicine and biotechnology by K.I. Skryabin, Moscow
4 Moscow Pedagogical State University, Moscow
5 Naberezhnye Chelny Institute for social and pedagogic technologies and resources, Naberezhnye Chelny
6 Smolensk state university, Smolensk
7 Emanuel Institute of Biochemical Physics, Mosсow
Разработка методов перорального введения пептидных ростовых факторов сельскохозяйственным животным, в частности, в составе рекомбинантных пробиотических препаратов, может рассматриваться в качестве перспективного подхода к снижению себестоимости животноводческой продукции и обеспечения конкурентоспособности ее производства. Одним из наиболее эффективных в этом отношении средств является соматолиберин – релизинг-фактор гормона роста. В связи с этим целью работы было создание новых векторных систем для экспрессии полусинтетических генов соматолиберина курицы, способных стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов со свойствами пробиотиков. Получены три конструкции, содержащие промотор гена wprА, мини-ген Е-пептида и производные гена соматолиберина, кодирующие либо пептид-предшественник (слитые GHRH и PACAP), либо фрагменты, соответствующие изолированным пептидным гормонам GHRH и PACAP. Сконструированы штаммы B. subtilis, несущие эти конструкции. Таким образом, созданы перспективные продуценты пептидных гормонов, позволяющие проводить испытания биологической активности живых пробиотических препаратов, содержащих производные соматолиберина птицы во внутриклеточной форме, путём их перорального введения.
Establishing methods of per orem administration of peptide growth factors to farm animals within recombinant probiotic preparations may be suggested as an approach to reducing production cost of animal breeding and elevating its economic efficiency. Somatoliberin (GHRH, growth hormone releasing hormone) is one of the most promising compounds. In this respect, a new genetically sustainable vector system for semi-synthetic chicken somatoliberin gene expression in probiotic bacillary strains was designed. It includes wprA gene promoter, E-peptide min-gene and somatoliberin gene derivatives are engineered. Three expression constructs encoding either GHRH+PACAP common precursor, or fragments corresponding to the mature peptide hormones GHRH and PACAP were assembled. B. subtilis strains bearing these constructs in the chromosome were obtained. Therefore prospective peptide hormone producer strains suitable for testing biological activity of probiotics preparations bearing chicken somatoliberin up on per orem administration were obtained.
poultry
anabolic effect
somatoliberin
B. subtilis
SLN
GHRH
PACAP

В настоящее время применение стимуляторов роста на птицеводческих предприятиях приобрело массовый характер и является важнейшим фактором снижения себестоимости продукции и обеспечения ее конкурентоспособности в условиях быстрого роста производства. В то же время получение очищенных субстанций ростовых факторов, пригодных для парентерального применения, остается дорогостоящим в применении и требует длительных сроков на разработку. В результате птицеводческим хозяйствам приходится прибегать к массовому применению потенциально опасных для потребителя химических средств стимулирования роста: синтетическим стероидным гормонам [3]. Экономически эффективной и безо­пасной для человека альтернативой этому укоренившемуся на практике подходу является разработка живых вакцин и продуцентов ростовых факторов на базе полностью безопасных микроорганизмов, обладающих естественной антагонистической активностью к энтеропатогенам, в частности, мезофильных видов бацилл [5]. Этот подход не является полностью новым: в течение многих лет он оправдывает себя в ходе применения пробиотических штаммов, большинство из которых являются природными продуцентами бактерицидных пептидов.

Эти штаммы представляют собой экономически эффективный и полностью безопасный заменитель антибиотиков. Применение таких штаммов в качестве добавки в корм вызывает пролонгированный эффект подавления патогенной микрофлоры, в то же время, улучшая метаболический потенциал среды кишечника за счет синтеза витаминов, полисахаридов и других биологически активных веществ. В совокупности применение пробиотиков в птицеводстве существенно снижает смертность поголовья, приводя к повышению суточных привесов [5]. Введение в геном эффективных пробиотических штаммов бацилл генов ростовых факторов, в частности, гена соматолиберина, может существенно дополнить и расширить лечебно-профилактический эффект от их применения, практически не увеличивая затраты на получение препаратов по сравнению с традиционными штаммами.

Существенным фактором, осложняющим практическое использование потенциала пробиотических препаратов на основе бацилл, является несовершенство экспрессионных систем введения чужеродных генов в эти микроорганизмы. Существующие плазмидные векторы для бацилл не обладают достаточной репликативной и физиологической стабильностью. Кроме того, введение в организм сельскохозяйственных животных внехромосомных генетических элементов нежелательно с точки зрения биобезопасности [6].

Целью настоящей работы явилось создание новых векторных систем для экспрессии полусинтетических генов соматолиберина курицы, способных стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов при получении бактерийного препарата пробиотического назначения в промышленных условиях и пригодного для применения на отечественных птицеводческих предприятиях.

Материалы и методы исследования

Для конструирования рекомбинантных пробиотических штаммов бацилл был разработан и синтезирован вариант гена соматолиберина курицы, оптимизированный для экспрессии в бактериях. Для этого с помощью ПЦР из генома курицы были клонированы два экзона гена соматолиберина [4], которые затем были сшиты и введены в состав вектора pQE30 (Qiagen, США). Геномная ДНК курицы была выделена из мышечной ткани методом фенольной экстракции [2, 7]. Полученная базовая конструкция pQE-SLN была использована для амплификации искусственных генов, кодирующих производные предшественника соматолиберина (пептиды GHRH и PACAP) с последующим введением ПЦР-продуктов желаемой последовательности в состав вектора pQE30 и получением конструкций pQE-GHRH и pQE-PACAP. Полученные конструкции использовали для получения интегративных векторов для экспрессии в клетках B. subtilis. Для этого в конструкцию pQE-SLN вводили промотор гена WprA B. subtilis и мини-ген Е-пептида устойчивости к эритромицину. Правильность трансгенной вставки контролировали посредством прямого секвенирования.

Результаты исследования и их обсуждение

На основании известной интрон-экзонной организации гена соматолиберина курицы были сконструированы две пары праймеров SLN1-SLN2 и SLN3-SLN4 (рис. 1). Праймеры позволяли получить ген соматолиберина, кодирующий полноразмерный зрелый гормон без пропептида и секреторного лидера, аминокислотная последовательность которого соответствует сплайсоформе I первичного транскрипта. На 5'-конец праймера SLN3 была введена последовательность из 20 нуклеотидов, комплементарная праймеру SLN2, что позволяло продуктам ПЦР, полученным с использованием праймеров SLN2 и SLN3, взаимно отжигаться друг с другом. С помощью пары праймеров SLN1-SLN2 на матрице геномной ДНК курицы был получен продукт размером 104 п.н., включающий последовательность II экзона гена соматолиберина, а с помощью пары праймеров SLN3-SLN4 - продукт размером 241 п.н., соответствующий III экзону того же гена.

Первичные продукты ПЦР были очищены элюцией из агарозного геля, объединены и использованы в качестве матрицы для проведения ПЦР с праймерами SLN1-SLN4. В результате был получен продукт размером 325 п.н. После элюции из агарозного геля он был обработан рестриктазами BamHI и SalI и клонирован в вектор pQE30, предварительно расщепленный по сайтам BamHI и SalI. В итоге была отобрана конструкция pQE-SLN, содержащая ген соматолиберина желаемой последовательности.

Рис. 1. Последовательности праймеров для амплификации II (а) и III (б) экзонов гена соматолиберина курицы, кодирующих полноразмерный зрелый гормон, с указанием полученных ПЦР-продуктов. Здесь и далее последовательности экзонов выделены серым цветом, сайты рестрикции выделены жирным шрифтом и подчеркнуты

Полученная конструкция pQE-SLN дала высокую продукцию рекомбинантного белка, который был очищен до гомогенного состояния. Поскольку максимальная эффективность действия соматолиберина достигается только в присутствии агониста - аденилатциклаза-активи­рую­щего пептида (PACAP), а в геноме млекопитающих ген PACAP существует независимо от гена соматолиберина (GHRH), разработанную конструкцию pQE-SLN использовали в качестве исходной для получения искусственных генов, кодирующих производные предшественника соматолиберина - пептиды GHRH (рис. 2а) и PACAP (рис. 2б).

На матрице pQE-SLN был проведен ПЦР с праймерами SLN1-SLN102 (размер продукта 156 п. н.) и праймерами SLN101-SLN4 (размер продукта 181 п. н.). После элюции из агарозного геля эти продукты были обработаны рестриктазами BamHI и SalI и клонированы в вектор pQE30, предварительно расщепленный по сайтам BamHI и SalI. В итоге были отобраны конструкции pQE-GHRH и pQE-PACAP, содержащие последовательности генов пептидов GHRH и PACAP, соответственно.

Полученные базовые конструкции pQE-SLN, pQE-GHRH и pQE-PACAP были использованы для получения интегративных векторов для экспрессии в клетках B. subtilis. Для этого в конструкции вводили промотор гена WprA B. subtilis, служивший одновременно плечом для гомологичной рекомбинации при интеграции в геном бактерии, и мини-ген Е-пептида, придающий бациллам устойчивость к эритромицину.

ДНК-дуплекс искусственного мини-гена Е-пептида был получен с использованием праймеров Em1 и Em2 (рис. 3а) в эквимолярном соотношении с последующей достройкой полимеразой Pfu или обратной транскриптазой Mu-MLV (Promega, США). Далее проводилась обработка ДНК-дуплекса эндонуклеазой рестрикции NdeI с последующим клонированием в вектор pET23, обработанный эндонуклеазами рестрикции NdeI и Ecl136II. Параллельно на матрице геномной ДНК B. subtilis AJ73 была проведена ПЦР-амплификация фрагмента, содержащего промотор гена wprА с праймерами Wpr1 и Wpr2 (рис. 3б).

Рис. 2. Последовательности праймеров для амплификации генов пептидных гормонов GHRH (а) и PACAP (б) соматолиберина курицы с указанием полученных ПЦР-продуктов

Далее проводилась обработка продукта ПЦР эндонуклеазами рестрикции BglII и XbaI и лигирование с плазмидной ДНК конструкции на базе вектора pET23, несущей мини-ген Е-пептида устойчивости к эритромицину (рис. 3в).

После этого осуществлялся перенос фрагмента ДНК, содержащего промотор гена wprА и мини-ген Е-пептида, в базовые конструкции pQE-SLN, pQE-GHRH и pQE-PACAP. Для этого проводилась обработка ДНК конструкций эндонуклеазами рестрикции XhoI и EcoRI, препаративная очистка фрагмента конструкции pET23-wprA-mE длиной 999 п.н. элюцией из агарозного геля и последующее лигирование очищенного фрагмента с расщепленной и очищенной фенольной экстракцией плазмидной ДНК конструкций pQE-SLN, pQE-GHRH или pQE-PACAP. Полученные конструкции pQEwprA-mE-SLN (рис. 4), pQE-wprA-mE-GHRH (рис. 5а) и pQE-wprA-mE-PACAP (рис. 5б) вводили в клетки штамма B. subtilis AJ73 (ВКПМ B-5036) методом химической трансформации [1].

Для детекции трансгенов была выделена геномная ДНК из культур клеток B. subtilis AJ73 и проведена ПЦР с использованием разработанных праймеров для получения продуктов амплификации, включающих последовательности фрагментов генов полноразмерного соматолиберина и его предшественников. Аутентичность продуктов ПЦР в виде фрагментов генов полноразмерного зрелого гормона соматолиберина SLN и производных предшественника соматолибери- напептидов GHRH и PACAP, была проконтролирована прямым секвенированием.

Рис. 3. Последовательности праймеров для амплификации мини-гена Е-пептида устойчивости к эритромицину (а) и промотора гена wprА (б) на матрице геномной ДНК B. subtilis c указанием последовательности, полученной после проведения ПЦР и лигирования плазмидной ДНК конструкции на базе вектора pET23, несущей промотор гена wprА и мини-ген Е-пептида устойчивости к эритромицину (в)

Рис. 4. Принципиальная схема плазмидной конструкции на базе вектора pQE30, содержащая промотор гена wprА, мини-ген Е-пептида и ген полноразмерного зрелого гормона соматолиберина SLN (конструкция pQEwprA-mE-SLN)

 

Рис. 5. Схемы плазмидных конструкций на базе вектора pQE30, содержащие промотор гена wprА, мини-ген Е-пептида и ген релизинг-фактора гормона роста GHRH (конструкция (а) pQEwprA-mE-GHRH) или ген аденилатциклаза-активи­рую­щего пептида PACAP (конструкция (б) pQEwprA-mE-PACAP)

Заключение

Таким образом, в настоящей работе предложен способ получения интегративных генетических конструкций для экспрессии гена полноразмерного зрелого гормона соматолиберина SLN и его предшественников - пептидов GHRH и PACAP, в бактериях для дальнейшего перорального введения птицам в составе пробиотического препарата на основе B. subtilis с целью получения анаболического эффекта.

Настоящая работа поддержана грантами в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» № 16.740.11.0196, № 14.740.11.1033, 14.740.11.0631, 16.512.11.2138.

Рецензенты:

  • Кузьмин В.А., д.х.н., зав. лабораторией ИБХФ РАН, ГУ Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, г. Москва;
  • Варгин В.В., д.м.н., доцент, ведущий научный сотрудник, ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН РФ, Московская обл.

Работа поступила в редакцию 13.03.2012