Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

THE PECULIARITIS OF REPRODUCTION OF DAPHNE CNEORUM L. IN VITRO

Semenova V.A. 1 Karpechenko K.A. 1 Kalaev V.N. 2 Lepeshkina L.A. 2 Mukovnina Z.P. 2 Serikova V.I. 2
1 Research Institute of Forest Genetics and Plant Breeding, Voronezh
2 Botanical garden of Voronezh state university by the name of professor B.M. Kozo-Polyansky, Voronezh
В статье обсуждается выбор способа стерилизации, оптимизации питательных сред, необходимых для достижения максимальной скорости роста и индуцирования ризогенеза кустарничка, занесенного в Красную Книгу РФ – волчеягодника борового (Daphne cneorum L.), культивируемого в ботаническом саду им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского государственного университета. Предложен полностью безгормональный способ микроклонального размножения, характеризующийся сниженным содержанием сахарозы в питательных средах, что способствует уменьшению риска возникновения сомаклональной изменчивости и удешевлению процесса тиражирования больших объемов растения. Выявлено, что методика стерилизации существенным образом влияет на процесс витрификации и дальнейшего размножения стеблевых эксплантов. Подобран оптимальный состав питательных сред для максимальной элонгации, увеличения коэффициента мультипликации и укоренения растений. Выявлено, что для размножения волчеягодника борового необходимо использовать первичные экспланты с удаленным апексом.
In this article the choice of a way of sterilization and optimization of the nutrient mediums necessary for achievement of the maximum growth and stimulation of root formation of a low shrub Daphne cneorum L. сultivated in the Botanical garden of the Voronezh state university is discussed. Daphne cneorum L. is brought in the Red Book of the Russian Federation as a vanishing species. A method of microclonal reproduction without hormones characterized by the lowered maintenance of sucrose in nutrient mediums is offered. This way leads to reduction of risk somaclonal variability and reduces the cost of derived plant material. The sterilization technique essentially influencing process of a vitrification and the further reproduction of stem explants is revealed. The optimal composition of nutrient mediums for maximum elongatoin is selected. Increase in the multiplier and the rooting of plants is picked up. The need for primary explants remote apex for reproduction of Daphne cneorum L. is established.
micro clonal reproduction
viable explant
culture medium
1. Vinogradov I.P., Golicyn S.V., Denisova L.V. Botanicheskie pamjatniki prirody Central’no-Chernozemnyh oblastej [Botanical nature monuments of Central Chernozem regions], Bulletin of Environmental Protection and preservation work in the USSR, 1960. no. 5, pp. 3–37.
2. Krasnaja kniga Rossijskoj Federacii (rastenija, griby) [The Red Book of Russian Federation (plants and fungi)]. Moscow, KMK Pabl., 2008. 855 p.
3. Maevskij P.F. Flora srednej polosy evropejskoj chasti Rossii [The flora of central European part of Russia]. Moscow, 2006. 600 p.
4. Ruckij I.A., Presnjakova M.A. Volchejagodnik Julii – novoe dekorativnoe rastenie v kul’ture [Daphne Julia – new ornamental plant in the culture]. Voronezh, VSU Publ., 1965. 26 p.
5. Tosun A. Chemical constituents and biological activities of Daphne L. species, J. Fac Pharm. 2006. Vol. 35. nо. 1, pp. 43–68.

Метод клонального микроразмножения имеет ряд преимуществ перед традиционными способами размножения. Это получение генетически однородного посадочного материала, свободного от вирусов; высокий коэффициент размножения растений, трудновоспроизводимых традиционными методами; возможность проведения работ в течение круглого года и другие. Метод основывается на явлении тотипотентности - свойстве клеток реализовывать генетическую информацию ядра, обеспечивающую их дифференцировку, а также развитие до целого организма. Таким образом, становится возможным регенерировать полноценное растение.

Выбор Daphne cneorum L. (Daphne julia K.-Pol.) - волчеягодника борового в качестве объекта исследования продиктован необходимостью сохранения вида, занесенного в Красную Книгу Российской Федерации [2]. Данный вид относится к редким эндемикам флоры России. В Воронежской области он весьма успешно интродуцирован в ботаническом саду Воронежского госуниверситета [4]. Однако в результате детального анализа литературных данных не было обнаружено работ по микроклональному размножению волчеягодника борового.

Целью работы явилось создание безвирусной коллекции клонов волчеягодника борового (Daphne cneorum) для сохранения ценных генотипов in vitro и ускорения процесса воспроизведения особо охраняемого вида. Для достижения поставленной цели необходимо было выбрать способ стерилизации, оптимизировать питательные среды, необходимые для достижения максимальной скорости роста и индуцировать ризогенез.

 Материалы и методы исследования

Волчеягодник боровой, или Юлии относится к семейству Thymelaeaceae (Волчниковые), насчитывающему в своем роду около 50 листопадных, полу- и вечнозеленых видов, обитающих в Европе, Азии и Северной Африке [2]. На территории Центрального Черноземья он встречается в Горшеченском, Мантуровском, Тимском, Ястребовском районах Курской области [1]. В Нечерноземье - в Брянской области. Растет на склонах с меловой подпочвой, меловыми обнажениями, реже по боровым пескам.

Волчеягодник боровой - низкорослый вечнозеленый кустарничек, высотой 20-30 см, в диаметре до 1 м. Ветви его покрыты темно-бурой корой. Листья кожистые, длиной 0,8-2 см, многолетние, обратнояйцевидные, сверху темно-зеленые, снизу сизоватые, собраны на верхушке ветвей в мутовки [3]. Многочисленные побеги заканчиваются соцветием - ложная головка с 10-25 мелкими цветками, источающими сильный приятный аромат. Венчик трубчатый от светло- до темно-розового цвета, около 0,5 см в диаметре. Плод - костянка, 6-7 мм длиной, 3-6 мм шириной. Зрелые плоды окружены прозрачным желтоватым околоплодником.

Цветение волчеягодника начинается в первых числах мая и продолжается 20-30 дней в зависимости от погодных условий. В этот период растения напоминают розовые подушки. Со второй половины лета бывает вторичное цветение, но менее обильное.

Размножают волчеягодник боровой свежесобранными семенами либо полуодревесневшими черенками, которые укореняют в первой половине лета. Растения волчеягодника хорошо переносят пересадку в возрасте 1-3-х лет. Позже у них развивается мощный веретеновидный корень, с годами уходящий на глубину более полутора метров.

Исследования проводили на растительном материале, выращенном в ботаническом саду им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета.

В начале опыта в сентябре двухлетнее растение волчеягодника из открытого грунта было переведено в условия закрытого грунта с контролируемыми показателями температурного и светового режимов. При температуре воздуха 26°С выше нуля, а также стандартных световых условиях (16-часовой фотопериод) растение нормально развивалось. Спустя 3 месяца волчеягодник обильно цвел и имел множество ювенильных побегов. По достижении длины побегов 3-5 см от них отрезали апикальную часть и стерилизовали.

С целью получения жизнеспособных эксплантов волчеягодника были проведены 3 варианта обработки верхушечных (ювенильных) участков стебля. Начальной стадией первых двух вариантов являлась 20-минутная промывка проточной водой для удаления сапрофитной микрофлоры. Последующие стадии включали: в первом варианте стерилизации обработку мертиолятом (0,015%) и бытовым отбеливателем «Белизной» (4%); во втором варианте - этиловым спиртом (96%). Третий вариант стерилизации исключал длительную промывку проточной водой и включал обработку только 96%-м этиловым спиртом. После стерилизации экспланты отмывали стерильной дистиллированной водой в течение 10 минут на качалке.

Концы проростков отрезали, нарезали их на отрезки с 3-4 междоузлиями и помещали в стерильные контейнеры на широко используемых питательных средах MS и ВТМ, различающихся по количественному составу макросолей и сахарозы, гормонов и активированного угля.

Субкультивирование, микрочеренкование и укоренение проводили на вышеуказанных питательных средах.

Результаты исследования и их обсуждение

При микроклональном размножении волчеягодника борового серьезной проблемой является витрификация растительного материала как на начальных, так и на более поздних этапах клонирования. Было предположено, что явление связано со стерилизацией первичных эксплантов. Поэтому на первой стадии работы исследовались различные варианты получения стерильных растений. Так, было показано, что при стерилизации мертиолятом в сочетании с «Белизной» наблюдается 100%-я витрификация растений, они практически не растут и со временем погибают. Аналогичное явление наблюдалось и при стерилизации, включающей удаление сапрофитной микрофлоры путем длительного промывания проточной водой с последующей обработкой неразбавленным этиловым спиртом. И только третий вариант стерилизации - кратковременное погружение растений в 96%-й спирт - оказался оптимальным для волчеягодника борового. При этом растения давали 100%-ю выживаемость и полное отсутствие витрификации (рис. 1). Данный факт позволяет предположить, что удлинение процедуры стерилизации приводит к излишнему обводнению растений и, как следствие, вызывает процесс витрификации эксплантов Daphne cneorum.

Стандартная методика микроклонального размножения требует использования гормонов роста хотя бы на первых стадиях введения эксплантов в условия in vitro. Так, с целью удлинения пробирочных растений и увеличения коэффициента мультипликации была использована низкосолевая среда 1/2 WPM, дополненная 0,2 мг/л БАП и 0,1 мг/л ГА3. После разрастания базальной части экспланта начинался рост адвентивных побегов по типу куста, достигающий в течение 4 недель количества 7-10 шт. на микрорастение. Побеги изолировали и помещали либо на безгормональные среды, либо (для дальнейшего увеличения коэффициента мультипликации) на 1/2 WPМ, дополненную вышеуказанными гормонами (рис. 2).

Рис. 1. Влияние метода стерилизации и состава питательных сред на процесс витрификации Daphne cneorum. Обозначения: MS, ½ MS, ¼ MS - среда Мурасиге и Скуга с разным набором макросолей; ½ WPM -среда для размножения древесных растений: 1 - длительная промывка проточной водой с дальнейшей обработкой мертиолятом + белизной; 2 - с обработкой 96% спиртом; 3 - стерилизация только 96% спиртом

Рис. 2. Микроклонально размноженные растения Daphne cneorum

Укоренение эксплантов происходило спонтанно в течение 3 недель на всех типах безгормональных сред: с активированным углем или без него, на 1/2 или 1/4 по макросолям MS. Однако часть растений укоренялась только после длительного выдерживания их на средах, дополненных 3 мг/л ИМК.

Отсутствие фитогормонов в процессе микроклонального размножения позволяет снизить проявления сомаклональной изменчивости.

Было обнаружено, что, во-первых, удлинение растений на безгормональных средах превышает их рост на среде с гормональными добавками. Во-вторых, элонгация на среде 1/4 MS превышает рост на среде 1/2 MS. Максимальный месячный прирост на данной среде составил 3-4 см, что в несколько раз превышает величину прироста в условиях открытого грунта (3-10 см за вегетационный период). После удлинения микрочеренки разрезали на 1-2 см сегменты и помещали на среды того же состава (рис. 3, 4).

Необходимо отметить, что экспланты, содержащие верхушечную точку роста, росли несколько медленнее, по сравнению с эксплантами, не имеющими последней. Часто наблюдалось явление апикального усыхания, характерное для размножения дуба черешчатого. Поэтому для лучшего размножения волчеягодника борового необходимо использовать первичные экспланты с удаленным апексом.

Заключение

Предложенный способ микроклонального размножения волчеягодника борового выгодно отличается отсутствием гормонов роста на всем протяжении цикла и сниженным содержанием сахарозы в питательных средах, что способствует уменьшению риска возникновения сомаклональной изменчивости и удешевлению процесса тиражирования больших объемов растения. Размножение волчеягодника осуществляли в культуре стеблевых ювенильных эксплантов.

Рис. 3. Зависимость роста эксплантов от типа питательной среды. Обозначения: № 1 - MS; № 2 - ½ MS; № 3 - ¼ MS; № 4 - ½ WPM + 0,2 БАП + 0,1 ГА3; № 5 - ½ BTM + 0,2 БАП + 0,1 ГА3

Рис. 4 Зависимость количества адвентивных побегов от типа питательной среды. Обозначения: № 1 - MS; № 2 - ½ MS; № 3 - ¼ MS; № 4 - ½ WPM + 0,2 БАП + 0,1 ГА3;
№ 5 - ½ BTM + 0,2 БАП + 0,1 ГА3

Изучение особенностей введения в культуру in vitro волчеягодника борового приобретает большое значение и по другим причинам. Имеются данные, что волчеягодник содержит различные соединения (включая биологически активные вещества), которые находят широкое применение в фармакологии [5]. Таким образом, применение метода микроклонального размножения позволит решить актуальную проблему быстрого воспроизведения редкого эндемика и сохранения его путем введения в широкую культуру.

Работа выполнена в рамках и при поддержке государственного контракта на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» № 16.518.11.7099.

Рецензенты:

  • Ершова А.Н., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биологии растений и животных естественно-географического факультета ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет», г. Воронеж;
  • Корнеева О.С., д.б.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий», г. Воронеж.

Работа поступила в редакцию 06.04.2012.