Одним из важных направлений прикладной биотехнологии является разработка эффективных биологических методов оценки состояния природной среды, загрязнение которой токсичными веществами в настоящее время приобрело комплексный характер. Для оценки токсичности природных вод, промышленных сбросов, почвы, кормов и прочих объектов окружающей среды, а также новых химических веществ и внутренних сред организма человека и животных используют тесты на различных живых организмах [2, 7].
Биотестирование на клеточно-организменном уровне начало широко применяться с конца 80-х годов ХХ века. На сегодняшний день успешно используются методы биотестирования, проводимые на естественных и модельных сообществах [1].
Общеизвестно, что свободно живущие инфузории очень быстро реагируют на изменение среды обитания и могут быть использованы в качестве индикаторов. При этом установлено, что одни виды при перенесении их в загрязненную среду погибают в течение первых минут или часов опыта, а для других видов эта же среда становится стимулирующей и вызывает интенсивное размножение. Биотестирование на инфузориях с большой степенью достоверности позволяет определить степень интегральной токсичности всех экотоксикантов, содержащихся в объекте исследования [2, 6].
Цель исследования - изучить специфические реакции организмов-гетеротрофов сенного настоя в ответ на загрязнение среды нефтепродуктами.
Материал и методы исследования
В качестве тест-объекта была использована 10-суточная культура сенного настоя, содержащая инфузории Paramecium caudatum, Colpoda aspera и коловратки семейств Philodinidae и Dicranophoridae. Дизельное топливо (ДТ) разводилось в дистиллированной воде в концентрациях 0,1; 1,0л и 10,0 мг/л. В чашках Петри в равных пропорциях смешивали 10-суточную культуру и водный раствор дизельного топлива разных концентраций. Объем пробы составил 4 мл. Контролем в эксперименте был сенной настой. Биотестирование проводили в течение 6 суток. Просмотр проб проводили через 15 мин, 1 ч, 24 ч, 2 сут, 4 сут, 6 сут при увеличении: об.10х, ок.10х. Подсчет инфузорий производили в 10 полях зрения. Пробы фотографировали при увеличении 1х, 1,5х, 2х, 3х. В течение месяца проводилось описание поведенческих реакций инфузорий и коловраток.
Результаты исследования и их обсуждение
На кафедре биоэкологии биологического факультета Мурманского государственного технического университета работы по изучению динамики микрокосма сенного настоя проводятся с 2010 года [4, 5]. Первым этапом этого исследования было эмпирическое накопление данных по качественному составу организмов, последовательно сменяющих друг друга. В результате установлено, что в каждой последующей серии опытов видовой состав населения сенного настоя отличался от предыдущей серии, однако порядок сукцессионного ряда соблюдался. Речь идет о свободноживущих инфузориях родов Colpoda, Paramecium, Oxytricha, Stylonichia, Vorticella. Все перечисленные инфузории могут присутствовать в сенном настое одновременно, однако продолжительные наблюдения показывают определенную закономерность сменяемости видов (рис. 1).
Рис. 1. Динамика численности инфузорий в сенном настое
Проводя регулярные подкормки молоком, в микрокосме можно создать условия, оптимальные для поддержания стабильной численности популяций инфузорий Paramecium caudatum, Oxytricha sp., Stylonichia sp. Коловратки в культуре, как правило, появляются по мере созревания сенного настоя.
В опыте по биотестированию водного раствора ДТ использована культура, выращенная на сенном отваре с добавлением воды из аквариума. Ответная реакция сообщества гетеротрофов была обусловлена индивидуальными свойствами таксонов к условиям среды.
Через 15 минут после смешивания культуры сенного настоя с растворами ДТ разных концентраций обнаружено, что парамеции резко снизили скорость движения. Они формируют группы численностью 10-20 экз./п.зр., преимущественно в детрите. Кольподы проявляют повышенную активность, выражающуюся в увеличении скорости движения по сравнению с контролем.
Контроль дает следующую картину: парамеции - 3 экз./п.зр., кольподы - 15-20 экз./п.зр., нормальной двигательной активности.
Спустя 1 час в растворах с ДТ обнаружены следующие изменения: парамеции активно движутся, скоплений практически не образуют, встречаются единичные неподвижные особи. Количество неподвижных (малоподвижных) инфузорий растет с увеличением концентрации нефтепродукта. В эти сроки опыта инфузории Colpoda aspera наиболее активно формируют группы численностью более 40 экз./п.зр. Отмечено появление мелких цист.
Через 1 сутки после начала опыта в контрольном растворе количество парамеций достигает 4-5 экз./п.зр., количество кольпод в среднем составляет 18 экз./п.зр. Большинство организмов в активном состоянии.
В водных растворах ДТ разной концентрации наблюдается экспоненциальный рост Colpoda aspera. Вспышка численности кольпод отмечена во всех пробах с ДТ. Численность организмов составила более 150 экз./п.зр. (рис. 2а). Они отличаются повышенной двигательной активностью. Цитоплазма инфузорий вакуолизирована. Число пищеварительных вакуолей у кольпод возрастает до 4-5 шт. Численность парамеций в растворах с ДТ также существенно возросла и составила 15-40 экз./п.зр. Отмечено увеличение количества пищеварительных вакуолей у парамеций. Размеры инфузорий увеличены в 1,5-2 раза по сравнению с контрольными экземплярами (рис. 2б). В детрите парамеции образуют группы численностью выше 50 экз./п.зр.
Рис. 2. Проба Сдт = 10,0 мг/л спустя 1 сутки: а - экспоненциальный рост Colpoda aspera; б - увеличение размеров Paramecium caudatum; ув. микроскопа об. 10х, ок. 10х; ув. фотоаппарата 1,5х, 3х
Подавляющая часть инфузорий активна, однако можно отметить некоторое снижение двигательной активности. С ростом концентрации водного раствора ДТ двигательная активность парамеций снижается. Многие инфузории активно делятся. Факт скачкообразного увеличения численности инфузорий можно объяснить тем, что в водных растворах ДТ при t = 20°С активно развиваются нефтеокисляющие бактерии, которые являются источником пищи для инфузорий-бактериофагов. Потребление нефтесодержащей органики происходит по схеме: ДТ - нефтеокисляющие бактерии - инфузории (кольподы, парамеции).
Тест-объект P. caudatum обладает высокой чувствительностью, но одновременно и высокой устойчивостью по отношению к загрязнению воды. Популяция P. caudatum способна адаптироваться к загрязнению воды дизельным топливом. Фактор питания на ранних этапах взаимодействия с загрязняющим веществом преобладает над токсичностью [3].
Спустя 2 суток в контроле существенных изменений, касающихся численности парамеций и кольпод, не обнаружено. Отмечено появление инфузорий Colpoda cucullus и единичных одноклеточных водорослей.
В растворах ДТ разных концентраций выявлены такие изменения: во всех пробах численность парамеций уменьшилась в 1,5-2 раза, численность кольпод катастрофически снизилась практически до начального уровня. Большинство парамеций медленно двигается, количество пищеварительных вакуолей достигает 4-6 шт. На этом сроке опыта подавляющая часть кольпод неподвижна.
Через 4 суток контрольный сенной раствор был представлен парамециями численностью до 2-3 экз./п.зр. Инфузории C. aspera практически полностью цистировались.
В водных растворах ДТ численность C. aspera резко упала и составила от 3 до 12 экз./п.зр. Во всех пробах отмечается появление инфузории C.cucullus. Численность парамеций существенно не изменилась и колебалась в пределах 10-30 экз./п.зр. Количество пищеварительных вакуолей у парамеций уменьшилось.
Через 6 суток состав и численность инфузорий в контрольном растворе не претерпел существенных изменений. Во всех испытуемых растворах ДТ отмечается снижение численности парамеций, уменьшение их размеров. Сокращение пищеварительных вакуолей отмечается во всех пробах, кроме пробы с Сдт = 10,0 мг/л. Численность парамеций колебалась в пределах 8-25 экз./п.зр. Численность C.aspera представлена единичными экземплярами. В результате конкуренции (выедания) их заменили более крупные кольподы. Движение инфузорий замедлено, часть организмов находится в неподвижном состоянии.
Динамика численности инфузорий Paramecium caudatum и Colpoda aspera в течение опыта представлена на рис. 3а, б.
Таким образом, проведенный эксперимент показал, что раствор ДТ заданных концентраций оказывает стимулирующее действие на инфузорий P. сaudatum и C. aspera в первые сутки. Фактор питания на ранних этапах взаимодействия с растворами ДТ преобладает над токсичностью.
В последующие сроки опыта наблюдается снижение численности парамеций в 1,5-2 раза. В поздние сроки опыта численность парамеций колебалась в диапазоне 8-25 экз./п.зр, что свидетельствует об адаптивных возможностях популяции P. сaudatum к действию ДТ. Численность кольпод в течение опыта изменялась скачкообразно. На поздних сроках опыта их численность снизилась, они единично встречались в поле зрения микроскопа.
Рис. 3. Динамика численности Paramecium caudatum (а) и Colpoda aspera (б) в течение опыта
В течение всего времени наблюдения в пробах отмечено присутствие коловраток, относящихся к двум семействам Philodinidae и Dicranophoridae. Экспоненциальное увеличение их численности совпадает с уменьшением количества инфузорий. На рис. 4 а, б, в представлен рост численности коловратки Philodina sp. в течение месяца.
Рис. 4. Рост численности Philodina sp. в опыте; ув. микроскопа об. 10х, ок. 10х. Ув. фотоаппарата 1х, 2х
Спустя 1 месяц ДТ образовало на поверхности раствора пленку, которая и послужила субстратом для массового развития коловраток и, по-видимому, источников питательных веществ. По мере уменьшения площади пленки было отмечен переход коловраток в состояние анабиоза, или высыхания (рис. 5).
Рис. 5. Коловратки в состоянии анабиоза; ув. микроскопа об.10х, ок.10х.; ув. фотоаппарата 3х
Заключение
Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что раствор, содержащий ДТ в концентрациях, даже значительно превышающих ПДК, уже в первые сутки стимулирует размножение инфузорий. Причиной вспышки численности являются нефтеокисляющие бактерии, однако через двое суток численность инфузорий при всех концентрациях ДТ снижается, но остается во всех сериях опыта выше, чем в контроле. Следовательно, можно говорить о стимулирующей роли ДТ, содержащего органические вещества. В первые дни нефтяные углеводороды переходят в воду в больших количествах, а затем скорость перехода снижается, и уменьшение содержания питательных веществ вызывает инцистирование инфузорий [3]. Оставшаяся нефтяная пленка одновременно является субстратом и источником пищи для коловраток. По мере уменьшения площади органической пленки часть коловраток переходит в стадию покоя, или анабиоза.
Растворы ДТ первоначально ингибируют, а затем стимулируют развитие инфузорий и коловраток. Процесс самоочищения от ДТ достаточно длительный, и в его окислении принимают участие различные виды живых организмов: на начальном этапе - нефтеокисляющие бактерии, жгутиконосцы и инфузории, на конечном этапе - коловратки.
Своеобразие сменяющихся сообществ в определенной степени определяется нагрузкой по органическим загрязняющим веществам и эффективностью их разложения.
Полученные результаты будут использованы для разработки и апробации методики биотестирования загрязняющих веществ в рамках открытой на кафедре биоэкологии ГБ НИР «Разработка методов биоиндикации и биотестирования загрязнения пресноводных водоемов и их применение в условиях Кольского полуострова» (№ ГР 01201002677).
Рецензенты:
-
Зензеров В.С., д.б.н., ведущий научный сотрудник, Мурманский морской биологический институт КНЦ РАН, г Мурманск;
-
Шошина Е.В., д.б.н., профессор кафедры биологии, ФГБОУ ВПО «Мурманский государственный технический университет», г. Мурманск.
Работа поступила в редакцию 19.03.2012.