Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,118

THE COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF MECHANICALLY MODIFIED WITH SORBTION ON NANOSTRUCTURED PARTICLES OF SILICIUM DIOXIDE FORMS OF CEFTAZIDIME

Dushkin A.V. 1 Lykov A.P. 2 Larina O.N. 3 Goldina I.A. 4 Safronova I.V. 4 Guskov S.A. 1 Evseenko V.I. 1 Gaidul K.V. 4 Lyakhov N.Z. 1 Kozlov V.A. 4
1 Institute of Solid State chemistry and Mechanochemistry SB RAS, Novosibirsk
2 Scientific Research Institute of molecular biology and biophysics SB RAMS
3 FSI Novosibirsk’s interregional veterinary laboratory, Novosibirsk
4 Institute of Clinical Immunology SB RAMS, Novosibirsk
Проведено сравнительное исследование антимикробной активности официнальной и механически модифицированных форм цефтазидима, сорбированных на наноструктурированных частицах диоксида кремния при экспериментальном сепсисе, индуцированном Pseudomonas aeruginosa, у мышей (CBA×C57Bl/6)F1. Модификация цефтазидима осуществлялась методом измельчения и формирования механокомпозитов из антибиотика и коллоидного диоксида кремния в шаровой мельнице, в различных массовых соотношениях антибиотика и диоксида кремния, с целью изменения его физико-химических свойств и терапевтической эффективности. Механохимическая обработка приводила к многократному увеличению массовой и количественной доли малоразмерных фракций частиц нано-SiO2 и увеличению количества цефтазидима, сорбированного наиболее биологически активными микро- и наноразмерными частицами. Модифицированный таким образом цефтазидим обладал более высокой терапевтической эффективностью при лечении экспериментального сепсиса у мышей, одним из возможных механизмов которой являлось повышение функциональной активности клеток моноцитарно-макрофагальной системы.
A comparative study of antimicrobial activity of officinal and mechanically modified forms of ceftazidime, adsorbed on the nanostructured particles of silica in experimental sepsis induced by Pseudomonas aeruginosa in (CBA×C57Bl/6) F1 mice has been conducted. The modification of ceftazidime was carried out by grinding and shaping of mechanocomposites of antibiotic and colloidal silicon dioxide mixture in a ball mill, in various mass ratios of the antibiotic and silicon dioxide, in order to change the physicochemical properties and therapeutic efficiency of the antibiotic. Mechanochemical treatment leads to a multiplex increasing of mass and quantitative proportion of low – sized fractions of nano – SiO2 and increasing of the quantity of ceftazidime, adsorbed on the most biologically active micro- and nano – sized particles. This modification of the ceftazidime had a higher therapeutic efficacy, on the base of the parameters of survival rate, in the treatment of experimental sepsis in mice, one of the possible mechanisms of which is the increasing of the functional activity of monocytic – macrophage system’s cells.
sepsis
nanoparticles of silicium dioxide
mechanical breaking
ceftazidime
1. Boldyrev V.V. Uspekhi khimii, 2006, Т.75, pp. 203-216.
2. Dushkin A.V. Khimiya v interesakh ustoychivogo razvitiya, 2004, Т.12, no3, pp. 251-274.
3. Kondrashova N.M. Plekhova N.G., Zavorueva D.V. Tsitologiya, 2010, Т.52, no. 7, pp. 588-596.
4. Khitruk N.M. Funktsionalnaya aktivnost fagocytov u bolnykh s infektsiyami, vyzbannymi virusom prostogo gerpesa. Avtoreferat k. M. N., Moskva, 2007, 28 p.
5. Lazareva I.B., Igonin A.A. Lechyaschiy vrach, 2004, no. 4, pp. 11-14.
6. Sidorenko S.V., Yakovlev S.V. Infektsii v intensivnoy terapii. Moskva, Bionika, 2003, 208 p.
7. Dushkin A.V. Mechanochemical synthesis of organic compounds and rapidly soluble materials: in High-energy ball milling. Mechanochemical processing of nanopowders. Woodhead Publishing Limited, Oxford, 2010, pp. 249-273.
8. Lodise T.P., Patel N., Kwa A. Predictors of 30-day mortality among patients with Pseudomonas aeruginosa bloodstream infections: impact of delayed appropriate antibiotic selection. Antimicrob. Agents Chemotherapy, 2007, Vol. 51,
pp. 3510-3515.
9. Park E.J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro. Toxicology Letters, 2009, Vol. 184, pp. 18-25.
10. Radin S., Ducheyne P., Kamplain T., Tan B.H. Silica sol - gel for the controlled release of antibiotics. I. Synthesis, characterization, and in vitro release. J. Mater. Res., 2001,
Vol. 57, pp. 313-320.
11. Witkauskiene A., Shrodeniene E.,, Dambrauskiene A. Pseudomonas aeruginosa bacteriemia: resistance to antibiotics, risk factors, and patient mortality. Medicina (Kaunas), 2010, Vol. 46, pp. 490-495.
12. Young L.S. Ceftazidime in the treatment of nozocomial sepsis. The Amer. J. Medicine, 1985, Vol. 79, pp. 89-95.

Проблема эффективной комплексной терапии инфекционных заболеваний относится к числу наиболее актуальных в современной медицине. Ведущая роль в этой терапии отводится антибактериальным препаратам, адекватное применение которых определяет эффективность лечения [5]. Несмотря на мощный арсенал антибактериальных средств, количество гнойно-септических осложнений в различных областях хирургии остается высоким [6]. Одной из причин данных осложнений является формирование антибиотико-резистентных штаммов бактерий. В настоящее время Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), вызывающая нозокомиальные инфекции и, в частности, сепсис, при котором смертность стабильно высока [8], рассматривается как один из наиболее значимых микроорганизмов, характеризующихся высокой резистентностью к антибактериальным препаратам [5, 11].

В настоящее время твердофазная механохимическая технология получения композиций лекарственных препаратов с веществами-«носителями» продемонстрировала свою эффективность для повышения фармакологической активности и безопасности ряда лекарственных препаратов [1, 2, 7]. Так как антибиотикотерапия является одним из базовых компонентов интенсивной терапии сепсиса, создание новых соединений антибиотиков с широким антимикробным спектром, низкой токсичностью и высокой антибактериальной активностью на основе методов механохимии является актуальным.

Целью данного исследования было сравнительное изучение антимикробной активности различных форм цефтазиди- ма - официнальной и модифицированных механохимической обработкой, сопровождаемой сорбцией на наноструктурированных частицах диоксида кремния в различных соотношениях.

Материал и методы исследования

Цефтазидим, антибиотик группы цефалоспоринов III поколения, является препаратом выбора для лечения нозокомиального сепсиса, ассоциированного с P. aeruginosa [12].

Модификация цефтазидима осуществлялась путем механической обработки смеси антибиотика и коллоидного диоксида кремния (SiO2) (энтеросорбент «Полисорб», Россия) в шаровой мельнице (энергонапряженность 1g) в массовых соотношениях антибиотик/SiO2 - 100:1; 75:1; 60:1; 50:1 и 30:1 [2], с целью формирования механокомпозитов и изменения физико-химических свойств антибиотика. Электронные микрофотографии наноструктурированного SiO2 (нано - SiO2) получали на электронных микроскопах JEOL HITACHI (Япония). Гранулометрический состав водных суспензий исходного диоксида кремния и его композиций с цефтазидимом определяли на лазерном гранулометре Micro-Sizer 201 (Россия). Концентрации водных растворов цефтазидима определялись методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1200 (США).

Для оценки степени сорбции навеску композиции антибиотик/диоксид кремния, рассчитанную для получения раствора с концентрацией цефтазидима 100 г/л, суспендировали в 5 см3 дистиллированной воды и центрифугировали в течение 30 мин при скорости 12000 об/мин. Затем надосадочную жидкость сливали, осадок повторно суспендировали в таком же количестве дистиллированной воды. Концентрация антибиотика, десорбировавшегося в водную фазу, определялась методом ВЭЖХ. Количество сорбированного антибиотика рассчитывалось из суммарного определения количества антибиотика, десорбировавшегося из нано-SiO2. Было экспериментально определено, что более 95 % сорбированного антибиотика удается «извлечь» уже за 2 цикла осаждения/суспендирования.

Биологические эксперименты проводили на мышах - самцах (CBA×C57Bl/6)F1, в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08. 1977 г. № 755). Для оценки терапевтической эффективности цефтазидима использовали модель экспериментального сепсиса у лабораторных животных, индуцированного P. аeruginosa.

Для индукции сепсиса мышам внутривенно вводили 24-часовую культуру P. aeruginosa ATCC № 27853 в объеме 0,5 мл (5·108 КОЕ/мышь). Через 24 часа от момента индукции септического процесса, в течение 3 дней, ежедневно, внутривенно, однократно вводили контрольной группе живот- ных - 0,9 %-й раствор хлорида натрия, а опытным группам - по 2,5 мг/мышь (0,25 мл) раствора нативного цефтазидима или механокомпозита из различных соотношений антибиотика и нано-SiO2. Все исследуемые группы состояли из 10 животных. Проведено 3 независимых эксперимента. Выживаемость мышей учитывали ежедневно, начиная со 2-х суток от момента индукции сепсиса, до 8 суток включительно. Влияние официнальной и модифицированной формы цефтазидима (цефтазидим/нано-SiO2 - 30:1) на фагоцитоз эритроцитов барана перитонеальными макрофагами, продукцию активных форм кислорода, уровень внеклеточного и внутриклеточного оксида азота (NO) in vitro исследовали в соответствии с методами [3, 4]. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Statistica 6,0. Результаты представляли в виде медианы (Me), нижнего и верхнего квартиля (Lq-Hq), достоверность различий рассчитывалась по Х2-критерию и U-критерию Манна-Уитни и принималась при значениях p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Структурные характеристики композиций. Использованный нами материал коллоидного аморфного диоксида кремния состоял из округлых наночастиц размером 20-100 нм, агрегированных в рыхлые агрегаты размером 5-100 мкм, что продемонстрировано на приведенных электронных микрофотографиях (рис. 1).

В водной среде агрегаты частично разрушались. При механохимическом получении композиций с цефтазидимом происходило дальнейшее уменьшение размеров агрегатов. Гистограммы и численные данные распределения по размерам частиц приведены на рис. 2 и в табл. 1.

 

Рис. 1. Электронные микрофотографии коллоидного аморфного диоксида кремния при различном увеличении: а - наноразмерный диапазон; б - микроразмерный диапазон

 

Рис. 2. Гистограммы распределения по размерам частиц (мкм) в водных суспензиях исходного коллоидного аморфного диоксида кремния (а) и его композиции с цефтазидимом в массовом соотношении цефтазидим/нано-SiO2 = 30/1

Таблица 1 Данные гранулометрического состава полученных микрокомпозиционных материалов в весовых (объемных) процентах от расчетного

Состав, условия получения

%, < 3, мкм

%, < 5, мкм

 %, < 10, мкм

Коллоидный диоксид кремния исходный

0,5

5,3

25,7

Цефтазидим/коллоидный нано-SiO2, 30/1 по весу, механическая активация в течение 2 часов

14,3

23,3

33,0

Цефтазидим/коллоидный нано-SiO2, 30/1 по весу, механическая активация в течение 4 часов

23,8

38,9

56,2

Из полученных данных следует, что в композициях, полученных механохимически, удается существенно увеличить массовую долю мелких (менее 3-5 мкм), потенциально наиболее биологически активных фракций частиц - носителей.

Иммобилизация антибиотика частицами диоксида кремния. Мы провели оценку количества цефтазидима, сорбированного на нано-SiO2. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2 Экспериментально определенная степень сорбции цефтазидима на коллоидном диоксиде кремния в полученных композициях при массовом соотношении цефтазидим/нано-SiO2 = 30/1

Длительность механической обработки, часов

Количество сорбированного антибиотика, мг /количество нано-SiO2, мг (вес. %)

Смесь без обработки

10,5 мг/16,7 мг(63 %)

0,5

6,7 мг/16,7 мг(40 %)

1

6,4 мг/16,7 мг(38 %)

2

6,4 мг/16,7 мг(38 %)

4

7,2 мг/16,7 мг(43 %)

Из механохимически полученных композиций антибиотик/нано-SiO2 образуются достаточно плотные осадки, тогда как при центрифугировании композиций, полученных простым смешиванием компонентов (без механохимической обработки), осадок SiO2 становится гелеобразным и содержит большое количество водной фазы исходной суспензии - фактически, раствора антибиотика. Таким образом, оценка количества сорбированного антибиотика в «физических смесях» антибиотик - Полисорб имеет завышенное значение. В пределах точности экспериментов (±10 %) количество сорбированного цефтазидима не меняется, и это позволяет выбирать минимально возможное время механической обработки в пределах 0,5-2 часов. При увеличении массовых соотношений антибиотика в композициях, полученных механохимически, цефтазидим/нано - SiO2 от 10/1 до 40/1, степень сорбции незначительно увеличивается - от ~35 % до ~40 %, что позволяет считать их приблизительно одинаковыми. Такая относительно неизменная степень сорбции и легкость высвобождения сорбированного антибиотика, по нашему мнению, указывает на объемный механизм сорбции за счет эффекта мезопористости использованного материала SiO2, то есть концентрационном накоплении антибиотика в порах частиц коллоидного диоксида кремния. Эта гипотеза позволяет предположить, что при увеличении массовых соотношений цефтази- дим/SiO2 степень сорбции останется приблизительно постоянной.

Однако независимо от возможного механизма сорбции, механохимическая обработка позволяет многократно увеличить массовую (до ~50 раз) и соответственно количественную долю малоразмерных (менее 3-5 мкм) фракций частиц нано-SiO2, и, тем самым, увеличить количество цефтазидима, сорбированного наиболее биологически активными микро- и наноразмерными частицами.

Исследование терапевтической эффективности модифицированного цефтазидима. В серии предварительных экспериментов была определена доза P. aeruginosa, составлявшая 5·108 КОЕ/мышь, которая приводила к 100 % гибели мышей в течение периода наблюдения.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что на 8 сутки от момента индукции сепсиса в контрольной группе, получавшей физиологический раствор, все мыши погибли от сепсиса. В группе мышей, получавших нативный цефтазидим, выживаемость животных составила 50 %. В то же время среди групп мышей, которым вводили модифицированные формы цефтазидима в виде механокомпозита, выживаемость при сепсисе была различной при разных соотношениях антибиотика и нано-SiO2. При соотношении цефтази- дим/нано-SiO2, равном 50:1 отмечена 100 %-я выживаемость мышей. По мере увеличения доли антибиотика и уменьшения доли нано-SiO2 в механокомпозите с 50:1 до 100:1 выявлено снижение выживаемости мышей к 8-м суткам эксперимента (рис. 3).

В то же время нано-SiO2 не обладает собственными антибактериальными свойствами, о чем свидетельствуют данные литературы [10], а также снижение выживаемости животных при дальнейшем увеличении доли нано-SiO2 до 30:1. При соотношениях антибиотик/нано-SiO2 60:1, 50:1 и 30:1 получены статистически значимые различия выживаемости между группами мышей, получавших лечение официнальной формой цефтазидима и модифицированными его формами.

Таким образом, сорбция цефтазидима на наноструктурированном SiO2 способствуют увеличению терапевтической эффективности данного антибиотика при экспериментальном сепсисе, индуцированном P. aeruginosa.

Так как исход любого гнойно-септического процесса зависит не только от антибактериальной активности антимикробного препарата, вирулентности и чувствительности к нему возбудителя заболевания, но и от способности макроорганизма противостоять инфекции, создание антибактериальных препаратов, обладающих способностью стимулировать противоинфекционную резистентность, является перспективным направлением фармакологии [6]. Способность нано-SiO2 проникать внутрь клетки [9] позволяет предположить возможность фагоцитоза данных частиц клетками системы мононуклеарных фагоцитов, с последующей их активацией и продукцией неспецифических факторов защиты. Поэтому для оценки функционального состояния клеток моноцитарно/макрофагальной системы мы изучали воздействие модифицированного цефтазидима (цефтазидим/нано-SiO2 - 30:1) на уровень фагоцитоза и продукцию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами мышей. Результаты трех независимых экспериментов представлены на рис. 4 и 5.

Рис. 3. Выживаемость мышей (CBA×C57Bl/6)F1 с экспериментальным сепсисом, индуцированным P. aeruginosa, на фоне лечения различными формами цефтазидима Примечание: Оф - официнальная форма цефтазидима; Мф - модифицированная форма цефтазидима; * - достоверность различий с контрольной группой; ** - достоверность различий между официнальным и модифицированным препаратом

Рис. 4. Влияние различных форм цефтазидима на уровень фагоцитоза и продукцию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами мышей in vitro Примечание: Оф - официнальная форма цефтазидима; Мф - модифицированная форма цефтазидима; * - достоверность различий между официнальным и модифицированным препаратом

Рис. 5. Влияние различных форм цефтазидима на уровень внутриклеточной и внеклеточной продукции оксида азота перитонеальными макрофагами мышей in vitro Примечание: Оф - официнальная форма цефтазидима; Мф - модифицированная форма цефтазидима; * - достоверность различий между официнальным и модифицированным препаратом

В результате проведенных экспериментов было выявлено увеличение внутриклеточной продукции NO и активных форм кислорода, а также более высокий уровень продукции NO во внеклеточное пространство и активация фагоцитоза перитонеальными макрофагами мышей под действием модифицированного цефтазидима (p < 0,05). Следовательно, применение механохимически модифицированного цефтазидима, сорбированного на наноструктурированном SiO2, приводит к повышению функциональной активности моноцитов/макрофагов.

Заключение

В результате использования механохимической технологии получения композиций антибиотик/нано-SiO2 происходит многократное увеличение доли наиболее биологически активных частиц нано-SiO2 в механокомпозите, которые одновременно являются «носителями» активного антимикробного агента - цефтазидима. При исследовании антимикробной активности механохимически модифицированного цефтазидима, сорбированного на наночастицах диоксида кремния, на основании его терапевтической эффективности на модели экспериментального сепсиса, индуцированного P. aeruginosa у мышей, было установлено, что более высокая активность характерна для модифицированных форм антибиотика при соотношениях антибиотик/нано-SiO2 30:1 - 60:1. Одним из предполагаемых механизмов повышения антимикробной активности является поглощение моноцитами/макрофагами частиц нано-SiO2 с сорбированным в них цефтазидимом и увеличение функциональной активности этих клеток, что, наряду с прямым антимикробным действием антибиотика, способствует санации макроорганизма от инфекции.

Рецензенты:

  • Павлов В.В., д.м.н., ведущий научный сотрудник, зав. отделением эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов ФГУ «Новосибирский НИИТО» Рос­здравсоцразвития, г. Новосибирск.
  • Смагин А.А., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией лимфодетоксикации НИИКЭЛ СО РАМН, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 26.01.2012.