Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Апоптоз представляет собой процесс физиологической клеточной смерти, который контролируется генетически и присущ всем клеткам человека [8]. Понимание молекулярных механизмов, вовлеченных в регуляцию апоптоза, способствует выяснению нарушений процессов клеточного роста при различных заболеваниях [7]. Факторы, вовлеченные в регуляцию процесса апоптоза, в настоящее время рассматриваются в качестве основных клеточных мишеней целенаправленной терапии в онкогематологии, а изучение характера апоптотических реакций под ее воздействием может служить лабораторным маркером эффективности и помогать в выборе рациональной химиотерапии [3]. Для качественного и количественного определения направленности апоптотических реакций в клетке был предложен ряд методов, позволивших раскрыть многие механизмы, лежащие в основе апоптотической и некротической клеточной смерти.

Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка результатов измерения апоптоза в клетках костного мозга больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в условиях индукции двумя методами: флуоресцентной микроскопией и проточной цитометрией.

Материалы и методы исследования

Исследование было проведено на гетерогенной популяции клеток костного мозга (КМ) у больных ХМЛ в хронической фазе (ХФ) (n = 14) - первая группа и в фазе бластного криза (БК) (n = 6) - вторая группа. У больных 1-й группы был получен полный гематологический ответ и полный или частичный цитогенетический ответ на терапию гливеком. Больные 2-й группы были включены в исследование до начала терапии гливеком. Разделение на группы было проведено на основе цитогенетических и клинико-гематологических данных согласно критериям European Leukemia Net [2].

На момент обследования у больных 1-й группы количество бластных клеток в КМ составило не более 1,2 ± 0,7 %, а у больных 2-й группы - 47,1 ± 11,9 %. Количество клеток с Ph(+) хромосомой у больных 1-й группы было в пределах 0-26 %. У больных 2-й группы Ph(+) хромосома определялась в 100 %.

1. Выделение клеток костного мозга

Клетки КМ были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколл-верографин с относительной плотностью 1,077 г/мл из 2 мл гепаринизированного костномозгового пунктата, полученного при стернальной пункции. После центрифугирования (40 минут при 1500 об./мин) отделяли клеточную фракцию, которую трижды отмывали раствором хлорида натрия 9 г/л. Выделенные клетки суспендировали в среде следующего состава (ммоль/л): NaCl - 119; KCl - 4,69; CaCl2 - 2,52; MgCl2 - 1,18; глюкоза - 5,5; KH2PO4 - 1,18; HEPES - 25; pH = 7,4 с добавлением 60 г/л раствора ЭДТА в соотношении 1/20 от объема костного мозга из расчета 1 мл раствора на 106 клеток.

На каждом этапе выделения клеток подсчитывали их количество в камере Горяева и определяли жизнеспособность по связыванию трипанового синего. Жизнеспособные клетки составляли в среднем 92-99 % от их общего числа.

2. Оценка апоптоза

Интенсивность апоптотических реакций в клетках КМ оценивали двумя методами: флуоресцентной микроскопией и проточной цитометрией.

2.1. Флуоресцентная микроскопия

Интенсивность реакций апоптоза оценивали по количеству клеток, связавших акридин оранж (АО) [1]. На предметное стекло помещали 5 мкл клеточной суспензии, содержащей клетки КМ, смешивали с равным объемом раствора АО (100 мкг/мл), затем накрывали покровным стеклом и просматривали под масляной иммерсией (Микроскоп Leica DM4000B, светофильтр H3). Изображение фиксировали с помощью видеосистемы на основе цифровой камеры. Подсчитывали не менее 100 клеток в разных полях зрения. Количество клеток, связавших АО (АО+ клетки), выражали в процентах от общего числа.

2.2. Проточная цитометрия

Интенсивность реакций апоптоза оценивали по связыванию клетками КМ двух маркеров - аннексина V и пропидий йодида (PI) с помощью набора реактивов ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I
(«BD Pharmingem^TM», США). Результаты выражали в процентах от общего числа клеток. Аннексин V применяли для выявления клеток, вступивших в апоптоз (аннексин V+ клетки). Пропидий йодид (PI) употребляли в качестве маркера жизнеспособности клеток (аннексин V-PI- клетки) и клеточного некроза (аннексин V- PI+ клетки). В каждом образце анализировали 10000 клеток. Мононуклеарные клетки костного мозга идентифицировали на основе CD45 флюоресценции. Анализировали недифференцированный клеточный пул по общему лейкоцитарному маркеру CD34 (CD34+ клетки).

3. Индукция апоптоза

Об апоптотической активности клеток КМ судили по разнице в количестве клеток в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза. Для оценки спонтанного апоптоза 4∙106 клеток инкубировали в 1 мл инкубационной среды. Индукцию апоптоза вызывали дефицитом глюкозы в среде инкубации, помещая то же количество клеток в минимальный объем среды (50 мкл). Количество клеток в состоянии апоптоза определяли после 18-часовой инкубации при температуре +37 °С.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0. Сравнение было проведено с использованием непараметрического метода Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении клеток в условиях флуоресцентной микроскопии учитывали следующие признаки: размеры ядра, характер распределения хроматина, наличие хроматиновых тел в цитоплазме, характер свечения ДНК. Акридинсвязывающая способность клеток была изучена во всех образцах КМ больных, включенных в 1-ю и 2-ю группы. Полученные данные представлены в табл. 1, из которой видно, что уровень спонтанного апоптоза и индуцированного в клетках КМ у больных ХМЛ в 1-й группе намного выше, чем у больных 2-й группы. Прирост количества АО+ клеток КМ в условиях индукции апоптоза в 1-й группе более чем в 10 раз превышает их прирост во 2-й группе (9,5 и 0,7 % соответственно).

Таблица 1

Связывание акридин оранжа клетками костного мозга
при спонтанном и индуцированном апоптозе

Примечания:

* - достоверность различий p < 0,005 по сравнению со 2-й группой;

** - достоверность различий p < 0,005 по сравнению со спонтанным апоптозом.

Представленные данные указывают на то, что клетки КМ у больных в фазе БК характеризуются низкой апоптотической активностью и способностью вступать в апоптоз в условиях его индукции.

Способность клеток КМ вступать в апоптоз в условиях индукции у больных ХМЛ в ХФ и фазе БК была оценена путем параллельного измерения числа клеток КМ в апоптозе методом проточной
цитометрии.

Поскольку целью исследования была сравнительная оценка методов, характеризующих апоптоз в клетках КМ, при проточной цитометрии направленно анализировали общеклеточный пул (недифференцированный клеточный пул). Способность клеток связывать аннексин V и пропидий йодид была изучена во всех образцах КМ больных, включенных в 1-ю и 2-ю группы. Полученные данные представлены в табл. 2. В 1-й группе количество аннексин V+ связывающих клеток в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза равнялось 14,2 и 23,6 % (прирост - 9,8). Во 2-й группе количество аннексин V+ клеток в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза составляло 4,2 и 4,8 % соответственно. Прирост числа клеток в состоянии апоптоза составил 0,6 %.

Таблица 2

Связывание аннексина V клетками костного мозга больных 1-й и 2-й групп
при спонтанном и индуцированном апоптозе

Примечания:

* - достоверность различий p < 0,005 по сравнению со 2-й группой;

** - достоверность различий p < 0,005 по сравнению со спонтанным апоптозом.

Как следует из табл. 2, уровень спонтанного и индуцированного апоптоза в клетках КМ, а также прирост количества клеток в условиях индукции у больных 1-й группы значительно выше соответствующих показателей 2-й группы.

Сравнительную оценку результатов, полученных методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, провели на основании того, что клетки для изучения процессов апоптоза в КМ для обоих методов отбирали из одних и тех же образов клеточной суспензии.

Аналитическую надёжность методов оценивали, сравнивая количество клеток с признаками апоптоза: АО+ клетки и аннексин V+ клетки. В табл. 3 представлены значения коэффициента корреляции (r) при сопоставлении результатов, полученных методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Значения коэффициента корреляции (r) указывают на возможность сравнения результатов, полученных при флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии по количеству клеток в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза.

Вопрос оценки способности клеток к апоптозу при различных заболеваниях остается актуальным для решения многих проблем теоретической и практической медицины, в том числе онкогематологии [4]. Изучение процессов апоптоза на клеточных культурах с помощью набора классических биохимических, микроскопических и более современных методов - проточной цитометрии и полимеразной цепной реакции, позволило выявить ряд принципиальных аспектов, касающихся вовлечения апоптоза в процессы гибели опухолевых клеток.

Таблица 3

Значения коэффициента корреляции (r)
при сопоставлении результатов, полученных при определении апоптоза методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Примечание. * - критерий достоверности р < 0,05.

Методы с использованием красителя АО - флуорохрома с характерными максимумами флуоресценции в области 530 нм и 640 нм продолжают с успехом применяться для выявления характера апоптотических изменений в различных клетках. Полагают, что данный краситель при встраивании в молекулу ДНК способствует выявлению апоптотических клеток по характерному яркому желто-зеленому свечению ядра. Жизнеспособные клетки обладают диффузной зеленой флуоресценцией. Клетки, подвергшиеся некрозу, характеризуются выраженным красно-оранжевым свечением [5]. Достоинством примененного нами варианта микроскопического метода является простота и невысокая стоимость реактивов, возможность оценки состояния ДНК по характеру свечения и достаточно четких признаков, подтверждающих факт необратимого вступления клетки в процесс апоптоза. Применение профессионального лабораторного микроскопа Leica DM4000B, оснащенного видеосистемой, позволило нам избежать субъективизма в оценке микроскопической картины, характерного для визуальной оценки.

Метод проточной цитометрии с использованием рекомбинантного аннексина V - белка, конъюгированного с флуорохромом, служит одним из наиболее быстрых и эффективных методов обнаружения апоптотических клеток [6]. При использовании дополнительного красителя - пропидий иодида (PI), метод позволяет одновременно определять интактные клетки, клетки, находящиеся в апоптозе и клетки в состоянии некроза.

К достоинствам данного метода относятся: возможность более раннего обнаружения инициации апоптоза в клетке, подсчет большего количества клеток, надежная стандартизация метода за счет наличия промышленно выпускаемых тест-систем и сертифицированных контрольных материалов.

Таким образом, полученные нами данные указывают на сопоставимость результатов оценки апоптотических реакций в клетках костного мозга. Вполне очевидно, что в клинической практике для изучения направленности апоптотических реакций в клетках предпочтение следует отдавать проточной цитометрии вследствие высокой стандартизации метода. В экспериментальных исследованиях микроскопический метод, использующий не только акридиновый оранжевый, но и другие флуоресцирующие красители, сохраняют свою актуальность.

Рецензенты:

Максимов А.Г., д.м.н., доцент, доцент кафедры факультетской терапии ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны РФ, г. Санкт-Петербург;

Богданов А.Н., д.м.н., профессор, профессор кафедры терапии и ревматологии им. Э.Э. Эйхвальда Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, г. Санкт-Петербург.

Работа поступила в редакцию 07.07.2011.