Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

THE MORPHOLOGY OF ELODEA LEAF CELLS DURING OF ALCHOCOL-FORMALIN FIXATION


Показано, что при действии фиксатора на живые клетки листа Элодеи их площадь уменьшается до 75–90 % от исходной площади в контроле. После промывки водой площадь клеток увеличивается, но не достигает контрольного уровня. Происходят быстрая экстракция хлорофилла из хлоропластов, их сморщивание и остановка кругового движения, цитоплазма клеток приобретает мелкоскладчатый характер с появлением многочисленных ячеистых структур.
It is show that the areas of alive cells in Elodea leaf are decreased to 75–90 % at action of alcohol-formalin fixation. After washing with water area of the cells was increased, but does not reach the control level. There is a fast extraction of chlorophyll from the wrinkling chloroplasts and сеssation of cytoplasmic circular strеaming. Into cells there are some vеsiсulation and othеr altеration of thе сytoplasm struсturеs. Keywords: chemical fixation, living plant cells, morphology of plant cells, morphometric analysis

В настоящее время есть достаточный набор технических средств для реализации трехмерной реконструкции геометрии клеток и тканевых структур с помощью конфокальной микроскопии [7 и др.] или использования серийных срезов фиксированного материала [5, 6]. В связи с этим изучение действия химических фиксаторов на морфологию клеток, в частности растительных клеток, приобретает важнейшее значение, т.к. без учета изменения морфологии клеток под действием фиксаторов можно получить искаженную объемную модель изучаемых клеток и ее структур. Обсуждение роли морфологических артефактов при 3-мерной реконструкции клеток животных с использованием серийных срезов приведено в специальном обзоре [2]. Изучение действия химических фиксаторов на морфологию клеток представляет одну из важнейших и старых проблем цитологии и цитохимии [3, 8, 9].

В данной работе, приведены результаты изучения динамики изменения некоторых морфометрических характеристик живых растительных клеток при действии спирт-формалинового фиксатора, широко используемого в растительной гистологии и гистохимии.

Материал и методы исследования

В работе использован лист Элодеи (Elodeae сanadensis Michx.). Мелкие верхушечные листочки целиком помещались в специальную проточную термостатированную микрокамеру объемом 50 мкм3 [4]. Все опыты проводились при температуре 20 ºС, состав спирт-формалинового фиксатора: этиловый спирт (96 %) и формалина (4 %, приготовлен из параформа), в соотношении 1:6. Проток растворов через микрокамеру осуществлялся перистальтическим микронасосом рр1-05, Польша, Zalimp), скорость протока 333 мкл/мин. Использовался инвертированный микроскоп Olympus IX 71, соединенный с 3-матричным видекамкордером HD GY101 (фирма JVC, Япония) и видеомонитором PWM-14M2E (Sony, Япония). Обработка видеофильмов осуществлялась программой Pinnacle Studio 9.0. Изображения отдельных кадров обрабатывались графическим редактором AdobePhotosop 7.0 (перевод в черно-белые 8-ми битовые изображения, фильтрация - усиление резкости границ). Измерение площадей проводилось при помощи программы PhotoM (http://t_lambda.chat.ru). Контур каждой клетки измерялся 5 раз и рассчитывалась средняя величина площади контура. Статистическая обработка результатов осуществлялась при помощи программы Statistica v.6.0. Всего было снято 8 видеофильмов, два из которых подвергнуты морфометрическому анализу.

Результаты исследования и их обсуждение

Эксперимент 1. Временная диаграмма эксперимента приведена на рис. 1.

После начала протока воды, через 15-20 мин, начинается интенсивное круговое движение крупных хлоропластов в клетках (на временной шкале опыта, рис. 1, это время не показано). Общий вид клеток листа в разные периоды видеосъемки представлен на рис. 2. Были выбраны 17 клеток верхнего слоя клеток листа элодеи, площадь которых измерялась в димнамике фиксации. Начальная площадь клеток была в пределах от 800 до 1440 мкм2 (табл. 1).

pic

Рис. 1. Временная диаграмма эксперимента 1. Обозначения: В - проток воды; Ф - проток фиксатора; н+ и н- - насос включен (проток) или выключен (протока нет); с - периоды видеосъемки; к1 - к8 - кадры, взятые из видеофильма для морфометрического анализа, в скобках указаны времена соответствуюших кадров в общей шкале временной шкалы эксперимента

 pic

pic

Рис. 2. Изменение морфологии клеток в динамике фиксации. Об.10х. Пластинки
(к.1 - к.4 - номера кадров, к.1, 4 - проток воды; к.2, 3 - действие фиксатора (см. рис. 1).
1-17 - номера клеток, площадь которых была измерена (табл. 1); к.5, 8 - проток воды;
к. 6, 7 - действие фиксатора

Хлоропласты эллипсоидной формы, скорость их кругового движения равна, в среднем, 2-3 мкм/с.

Таблица 1

Площади клеток листа Элодеи в динамике фиксации (рис. 2)

Номер клеток

к1 Вода Н Начало опыта (100 %) M ± m

к2 Фиксатор

к 3 Фиксатор

к 4 Вода

M ± m                  

%

M ± m                 

%

M ± m                           

%

1

1440,9 ± 19,3(4)

1275,7 ± 57,6(4)

88,5

1208,6 ± 18,8(6)

83,9

1380,5 ± 8,5 (3)

95,8*

2

1192,3 ± 25,7(7)

876,0 ± 12,8(3)

73,5

868,8 ± 17,8(6)

72,9

1107,4 ± 11,3(8)

92,9

3

1103,8 ± 32,8(3)

830,2 ± 31,9(3)

75,2

820,9 ± 20,1(6)

74,4

1046,0 ± 27,2(3)

94,8*

4

1502,7 ± 10,1(8)

1252,9 ± 19,6(8)

83,4

1330,1 ± 24,9(6)

88,5

1463,2 ± 8,4(3)

97,4*

5

940,0 ± 28,9(3)

854,5 ± 10,4(3)

90,9

667,8 ± 14,2(6)

71,0

923,6 ± 21,9(3)

98,2*

6

1127,1 ± 7,1 (8)

964,0 ± 16,0(8)

85,5

998,9 ± 57,5(6)

88,6

990,0 ± 14,0(3)

87,8

7

1042,8 ± 3,8 (8)

887,7 ± 5,9 (8)

85,1

881,4 ± 17,0(6)

84,5

1002,9 ± 3,4 (3)

96,2

8

965,6 ± 9,5 (8)

734,8 ± 6,6 (8)

76,1

826,2 ± 18,8(6)

85,6

932,8 ± 7,9 (3)

96,6*

9

975,0 ± 9,2 (8)

886,0 ± 9,8 (3)

90,9

841,5 ± 14,4(6)

86,3

941,4 ± 8,2 (8)

96,6

10

882,6 ± 22,3(3)

733,5 ± 15,0(3)

83,1

720,8 ± 20,4(6)

81,7

882,4 ± 22,3(3)

99,9*

11

1704,6 ± 40,7(4)

1575,1 ± 29,9(4)

92,4

1597,6 ± 18,1(6)

93,7

1685,5 ± 25,9(3)

98,9*

12

1153,8 ± 3,5 (8)

887,4 ± 5,5 (8)

76,9

983,5 ± 12,0(6)

85,2

1118,1 ± 22,5(3)

96,9

13

1194,7 ± 4,5 (8)

1026,4 ± 5,0 (8)

85,9

1021,0 ± 11,2(6)

85,5

1137,5 ± 11,46(8)

95,2

14

1254,4 ± 36,6(4)

1065,8 ± 55,1(4)

85,0

1057,5 ± 25,7(6)

84,3

1201,1 ± 5,4(3)

95,7*

15

904,6 ± 5,1 (8)

727,0 ± 5,3 (8)

80,4

845,6 ± 6,8 (6)

93,5

855,7 ± 9,3 (8)

94,6

16

990,4 ± 31,4(3)

873,8 ± 11,4(3)

88,2

792,3 ± 12,2(6)

80,0

935,1 ± 22,9(3)

94,4*

17

1007,6 ±  21,5(4)

898,4 ± 31,0(4)

89,2

828,3 ± 25,7(6)

82,2

900,0 ± 4,0 (3)

89,3

Примечание: площадь клеток в мкм2; M ± m - среднее значение ± ошибка средней величины; t-критерий рассчитывался между значениями площади в к 1 и к 2-4. Для всех приведенных данных Р < 0,05, кроме отмеченных * - разница недостоверна. В скобках - число измерений. Эксперимент 1, кадры 1-2-3-4 (см. рис. 2).

Продолжение табл. 1

Номер кле-ток

к 5 Переход от воды к фиксатору

к 6 Фиксатор

к 7 Фиксатор

                                      

к 8 Вода

M ± m

%

M ± m                 

%

M ± m

%

M ± m                   

%

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1

1263,9 ± 15,2(6)

87,7

1114,6 ± 17,7(6)

77,3

1179,5 ± 23,9(3)

81,8

1393,8 ± 22,8(6)*

96,7

2

984,7 ± 22,3(6)

82,7

871,0 ± 25,4(6)

73,0

868,4 ± 25,2(3)

72,8

1065,2 ± 24,9(6)

89,3

3

894,8 ± 21,4(6)

81,1

766,6 ± 18,5(6)

69,4

886,6 ± 23,8(3)

80,3

936,5 ± 19,1(6)

84,8

4

1306,5 ± 15,3(6)

86,9

1319,5 ± 36,2(6)

87,8

1372,2 ± 24,0(3)

91,3

1402,7 ± 18,7(6)

93,3

5

716,7 ± 25,6(6)

76,2

655,9 ± 16,3(6)

69,8

710,9 ± 25,16(3)

75,6

789,4 ± 33,3(6)

84,0

6

979,7 ± 46,0(6)

86,9

997,8 ± 21,3(6)

88,5

996,6 ± 30,6(3)

88,4

1097,2 ± 15,1(6)*

97,3

7

928,7 ± 22,1(6)

89,1

767,1 ± 26,0(6)

73,6

938,3 ± 18,2(3)

90,0

968,8 ± 22,6(6)

92,9

8

859,1 ± 21,8(6)

89,0

810,0 ± 15,3(6)

83,9

753,2 ± 43,2(3)

78,0

877,8 ± 26,1(6)

90,9

9

873,4 ± 18,4(6)

89,6

828,1 ± 23,1(6)

84,9

806,4 ± 24,1(3)

82,7

914,5 ± 11,6(6)

93,8

10

818,6 ± 11,7(6)

92,8

719,5 ± 16,4(6)

81,5

796,7 ± 53,8(3)

90,3*

857,7 ± 10,8(6)*

97,2

11

1599,1 ± 20,7(6)

93,8

1575,7 ± 21,3(6)

92,4

1522,7 ± 52,6(3)

89,3

1605,0 ± 23,7(6)*

94,1

12

1048,8 ± 24,0(6)

90,9

970,9 ± 15,3(6)

84,1

990,7 ± 22,9(3)

85,9

1036,4 ± 18,0(6)

89,8

13

1105,6 ± 11,4(6)

92,5

1105,9 ± 14,0(6)

92,6

1076,6 ± 50,2(3)

90,1

1076,7 ± 22,0(6)

90,1

14

1150,0 ± 19,2(6)

91,7

1097,5 ± 20,8(6)

87,5

1242,8 ± 46,6(3)

99,1*

1076,5 ± 28,3(6)

85,8

15

821,2 ± 16,8(6)

90,8

813,6 ± 14,1(6)

89,9

855,3 ± 25,7(3)

94,5

883,5 ± 11,6(6)*

97,7

16

887,8 ± 16,3(6)

89,6

829,4 ± 26,0(6)

83,7

887,6 ± 66,2(3)

89,6*

892,2 ± 12,2(6)

90,1

17

839,1 ± 27,8(6)

83,3

822,2 ± 28,9(6)

81,6

829,3 ± 35,1(3)

82,3

885,8 ± 20,1(6)

87,9

Примечания: t-критерий рассчитывался между значениями площади в к1 и к5-8. Для всех приведенных данных Р < 0,05;

* - разница недостоверна. В скобках - число измерений.Эксперимент 1, кадры 5-6-7-8 (см. рис. 1).

В первые секунды действия фиксатора во всех клетках наблюдается полная остановка движения хлоропластов, затем происходит усиление зеленого фона, что связано с разрушением хлоропластов и выходом хлорофилла в проточный раствор. При включении протока воды происходит постепенное восстановление площади клеток к исходному состоянию (рис. 2, к.4,5,8). Однако остановка движения и уменьшенное число хлоропластов в клетках необратимо. В конце опыта кратковременное включение протока фиксатора практически не изменяло картины (рис. 2, к.6,7).

Эксперимент 2. Временная диаграмма эксперимента приведена на рис. 3

pic

Рис. 3. Временная диаграмма эксперимента 2. Обозначения см. рис. 1

Для видеосъемки была выбрана клетка площадью около 400 мкм2 для того, чтобы она полностью помещалась в поле зрения микроскопа при увеличении объектива 40×0,4.

В первые секунды контакта фиксатора с клетками листа хорошо видно, что происходит сморщивание хлоропластов, цитоплазма клеток приобретает мелкоскладчатый характер, с появлением многочисленных ячеистых структур. Клеточные стенки слегка утолщаются, становятся «лохматыми». В конце опыта внешний вид клеток приближается к норме, хотя видно сильное уменьшение количества хлоропластов и остаточные в цитоплазме и клеточной стенке.

Заключение

Таким образом, можно резюмировать, что при действии на клетки спирт-формалинового фиксатора площадь клеток листа Элодеи уменьшается до 75-90 % от исходной площади в контроле. После промывки площадь клеток листа элодеи постепенно возвращается к норме, но не достигает контрольного уровня. Другими словами, в клеточной стенке сохраняется остаточная деформация, вызванная фиксатором. В классических работах Байкера показано, что спирт и формалин приводят к уменьшению объемов модельных систем (альбумин-желатиновые блоки) [3]. Cкорость проникновения формалина в клетки тычиночных волосков томатов равна 120 мкм/мин [9], добавление этанола практически не влияет на скорость проникновения в эти же клетки (данные для фиксатора Карнуа). Учитывая, что толщина листа элодеи равна в пределах 60-100 мкм, можно считать, что в наших опытах фиксация должна быть полной.

Таблица 2

Площади клетки (мкм2) в норме и после действия фиксатора

к.*

I Вода (1)

к.

II Фиксатор (1)

№ к.

III Вода (2)

к.

IV Фиксатор (2)

к.

V Вода (3)

1

427,2 ± 4,3**

9

334,9 ± 5,6

17

420,0 ± 3,4

25

367,7 ± 3,1

33

423,4 ± 5,4

2

447,6 ± 2,5

10

387,7 ± 3,6

18

416,3 ± 7,8

26

367,2 ± 3,7

34

433,9 ± 3,8

3

436,8 ± 3,3

11

372,7 ± 4,5

19

457,2 ± 4,2

27

344,3 ± 4,8

35

414,8 ± 1,8

4

457,4 ± 3,4

12

355,5 ± 4,1

20

435,5 ± 4,3

28

355,1 ± 3,1

36

437,7 ± 3,0

5

459,1 ± 3,8

13

348,0 ± 5,9

21

444,7 ± 4,3

29

360,0 ± 5,1

37

431,2 ± 2,5

6

455,8 ± 6,5

14

340,3 ± 4,8

22

461,8 ± 5,0

30

361,2 ± 3,8

38

458,8 ± 5,9

7

460,4 ± 3,0

15

351,8 ± 2,1

23

409,4 ± 2,7

31

351,6 ± 3,9

39

438,6 ± 7,0

8

444,2 ± 7,4

16

355,9 ± 3,8

24

412,3 ± 3,5

32

369,6 ± 5,4

40

442,7 ± 5,2

 

448,5 ±  2,3+

(100 %)

 

355,8 ± 2,9

(79,3 %)

 

432,2 ± 3,4

(96,3 %)

 

359,6 ± 3,1

(80,2 %)

 

435,1 ± 2,5

(97,0 %)

Примечание: * - номера кадров из видеофильма (см. рис. 3); ** - М ± m (5 измерений); Разница достоверна по t-критерию: между I - II и I - IV (P < 0,001); + - М ± m (среднее значение площади, суммированное по 8 кадрам - 40 измерений).

При изучении действия разных фиксаторов на живые растительные клетки (черешковые волоски Lусopersicum esсulentum), в частности показано, что этанол вызывал интенсивное вспенивание цитоплазмы, в то время как движение протоплазмы продолжалось. Другие фиксаторы, такие как альдегиды, содержащие ионы кальция, приводили сразу к остановке движения цитоплазмы и везикуляции канальцевой системы [8]. В обзоре Р.Барера приводятся данные о том, что действие фиксаторов приводит к серьезным изменениям структуры живых клеток («мягкие» фиксаторы, такие как формальдегид в меньшей степени, а такие как пикриновая кислота или сулема приводят к появлению серьезных морфологических артефактов [1]. В ряде работ, проведенных в первой половине прошлого столетия, делалась попытка развить традиционные методы изучения фиксации живых клеток (см., например, ссылки [1, 3]). Эти работы ясно показали, «...ценность такого подхода и для выбора наилучшего фиксатора, и для интерпретации картин фиксированных клеток. Удивительно, однако, этот интенсивный поиск более лучших фиксаторов, развитие электронной микроскопии не возродили интерес к этому направлению...» [8]. С сожалением можно констатировать, что эти слова не потеряли актуальность и в наше время.

Дополнительные материалы к данной статье изложены в http://cam.psn.ru. Работа выполнена на средства гранта РФФИ № 07-04-00510.

Список литературы

  1. Барер Р. Фазово-контрастная, интерференционно-контрастная и поляризационная микроскопия // Методы цитологичекого анализа; под ред. А.Л. Шабадаш.- М.: ИИЛ, 1957.- С. 107-178.
  2. Буданцев А.Ю., Айвазян А.Р. Компьютерная 3-х мерная реконструкция биологических объектов с использованием серийных срезов // Морфология.- 2005. - Т. 127, №1.- С. 72-78.
  3. Bаker J.R. Principlеs of Biological Microtechnique. - London: Methuеn, 1958.- Р. 19-155.
  4. Budantsev A.Yu. Microchambers for inverted microscopes // Biotechnic and Histochemistry. - 2007. - Vol. 82, № 4-5. - Р. 263-266.
  5. Budantsev A.Yu., Jakovlev Y.Y. 3-D Reconstruction of Biological Objects. The potencial of standard computer programs // Microscopy and Analysis. - 2000. - Vol. 67. - Р. 29-31.
  6. Fiala J.C. Reconstruct a free editor for serial section microscopy // Journal of Microscopy. - 2005. - Vol. 218, Pt. - Р. 52-61.
  7. Gray, J.D., Kolesik, P., Hoj, P.B., Coombe, B.G. Confocal measurement of the three-dimensional size and shape of plant parenchyma cells in a developing fruit tissue // The Plant Journal. - 1999. - Vol. 19. - Р. 229-236.
  8. Mersey B., МсCully М.Е. Monitoring of thе сoursе of fixation of plant сеlls // Journal of Microscopу. - 1978. - Vol. 114, Pt.1. - Р. 49-76.
  9. O´Brien T.P., McCully M.E. The study of plant structure principles and selected methods. - Melbourne: Blackwell Sci.Publ. - 1981. - Р. 4.19-4.36.

Рецензенты:

Новоселов В.И., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник Института биофизики клетки РАН, г. Пущино;

Асланиди К.Б., д.ф.-м.н., ведущий научный сотрудник Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Работа поступила в редакцию 11.04.2011.