Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

GENETIC RISK FACTORS OF THROMBOPHILIA FOR WOPMEN OF CHILDBEARING AGE IN WEST-SIBERIAN REGION

Цветовская Г.А., Чикова Е.Д., Лифшиц Г.И., Кох Н.В., Шевела А.И., Воронина Е.Н., Новикова Я.В., Махотина Н.Е.
Изучались частоты встречаемости полиморфизмов генов гемостаза и фолатного цикла у пациенток и с верифицированным диагнозом тромбозов различной локализации, и практически здоровых, проживающих в Западно-Сибирском регионе. Особенностьюженщин репродуктивного возраста с развившимся тромбозом в молодом возрасте явилось наличие мультигенного характера тромбофилии в 100 % случаев при низком проценте встречаемостимутаций генов фактора V (Лейдена) и фактора II (протромбина).Показано, чтоведение беременных женщин,решение вопроса о приемлемости КОК и ЗГТ не может решаться при тестировании ограниченного числа наиболее изученных генов, считающихся безусловными и строгими маркерами наследственной тромбофилии (FV, FП, MTHFR С677Т).
Frequency of polymorphism of hemostasis genes and folate cycle of almost healthy patients and patients with verified diagnosis of thrombosis of different location from Western Siberia was studied. The feature of women of childbearing age with thrombosis developed in youth was combination of various polymorphous versions of genes-candidates of thrombosis susceptibility (detected in 100 % of cases) with low frequency of gene mutations of factor V Leiden and factor II (prothrombin). It is shown that prenatal care and decision concerning the prescription of combined oral contraceptives and substitutive hormonal therapy can not be taken by testing of the limited number of most studied genes considered as the unconditioned and strict markers of inherited thrombophilia (factor V, factor II, MTHFR (С677Т)). Keywords: women of childbearing age, susceptibility for thrombosis, polymorphic genetic markers.

В основе многих видов акушерской патологии лежит развитие генерализованной микроангиопатии и тромбофилии, связанных с аутоиммунными нарушениями, гипергомоцистеинемией, наследственными дефектами системы гемостаза.Существенно возрастает риск развития тромбозов уженщин при наследственной предрасположенности к данной патологии в результате провоцирующих воздействий, таких как прием оральных контрацептивов, беременность, хирургические вмешательства. В то же время известно, чтообщие скрининговые тесты, используемые для выявления маркеров тромбинемии, не позволяют идентифицироватьту или иную причину склонности к внутрисосудистому свертыванию и, следовательно, этот прием недостаточен для выбора патогенетической терапии [3,5,6,8]. В этой связи особого внимания ученых заслуживают наследственныеформы недостаточности ингибиторов свертывания или аномалии коагуляционных протеинов, обусловливающих состояние предтромбоза и предрасположенности к тромбозу, поскольку встречаются у лиц молодого возраста и зачастую протекают без клинических проявлений [1,4,9].

В задачиданной работы входилоизучение частоты встречаемости полиморфных вариантов ряда генов, кодирующих протеины системы гемостаза ифолатного цикла упациенток Западно-Сибирского региона - практически здоровых и с верифицированным диагнозом тромбозов различной локализации.С этой целью проведено комплексное исследование венозной крови, включившее тестирование генов-кандидатов предрасположенности к развитиютромботических состояний.

Материал и методы

Для изучения распространенности полиморфизмов генов системы гемостаза и фолатного цикла были обследованы 290женщин-жительниц г. Новосибирска и Новосибирской области в возрасте от 16 до 43 лет. Генетическое тестирование образцов венозной крови проводилось по направлениям от гинекологов, терапевтов и уженщин, самостоятельно обратившихся в лабораторию генодиагностики ЦНМТ в Академгородке ИХБФМ СО РАН с тем, чтобы пройти тест на приемлемость контрацепции, гормонально-заместительной терапии (ГЗТ)или для выявления факторов, способных осложнять течение предстоящей беременности.Большинство женщин были направлены на тестирование 4-х генов - FVG1691A, FIIG20210A, MTHFRC677T, MTRRA66G. Проанализированы 2 группы пациенток - в 1-ю группувошли 265женщин без клинических проявлений тромбофилии, 2-ю группусоставили25 пациентокс различнымитромботическими осложнениями. У 4-х пациенток развилась массивная ТЭЛА в возрасте 21 года, 22, 36 и 43-хлет на фонеприема оральныхконтрацептивов (ОК) и ГЗТ, утрех пациентокдиагностирован ишемический инсульт в возрасте 21 год, 30 лет и42 года, остальные наблюдались стромботическими эпизодами в анамнезе - тромбозом глубоких вен (ТГВ), тромбофлебитом поверхностных вен.Средний возраст пациенток в обеих группах был сопоставим и составил 32,5+8,5 в 1-ой группеи 30,3+10 во 2-ой группе.В исследование вошли 19 генов-кандидатов(25 аллельных вариантов), продукты которых участвуютв коагуляционном каскаде, системе фибринолиза,поддержании сосудистого тонуса,метаболизме метионина и фолиевой кислоты. Генотипирование проводилось методом ПЦР с использованием конкурирующих TagMan-зондов, комплементарных полиморфному участку ДНК.

Статистическая обработка результатов

Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга и выявление ассоциаций методом χ2 проводили с помощью программы DeFinetti [13].Для всех статистических расчетов при p-value <0,05 результат считали статистически значимым.

Результатыи их обсуждение

Результаты определения нами частот встречаемости полиморфизмов генов предрасположенности к тромбофилии представлены в таблице.

Частота встречаемости аллелей, генотипов полиморфных локусов исследуемых
генов в 1-ой и 2-ой группахженщин репродуктивного возраста и их ассоциация
с тромбозами различной локализации (OR)

Группа

Частота
встречаемости аллеля (n)

Частота встречаемости генотипа (n)

Соответствие закону Харди-Вайнберга,

(χ²*, df=1), р

Выявленная ассоциация

OR, C.I. ,chi2, р

Полиморфный локус G1691A гена V фактора свертывания крови (лейденская мутация)

 

G

A

G/G

G/A

A/A

 

для аллеля А

OR =4
[0,76-21,1]
chi2=3,09
p=0,257

№ 1

0,99

0,01

0,98(247)

0,02(5)

0

p=0,874

№ 2

0,96

0,04

0,92(24)

0,08(2)

0

p=0,838

Полиморфный локус G20210A гена протромбина

 

G

A

G/G

G/A

A/A

 

для аллеля А

OR =2,5
chi2=0,42
p=0,52

№1

0,99

0,01

0,98(249)

0,02(5)

0

p=0,858

№ 2

1

0

1 (26)

0

0

 

Полиморфный локус С677 гена MTHFR

 

С

Т

С/С

С/Т

Т/Т

 

для аллеля Т

OR =1
chi2=0,04
p=0,84878

№ 1

0,71

0,29

0,48(122)

0,46(114)

0,06(16)

p=0,115

№ 2

0,72

0,27

0,55(15)

0,33(9)

0,11(3)

p=0,379

Полиморфный локус A66G гена MTRR

 

A

G

A/A

G/A

G/G

 

дляаллеляG

OR =4,8
[2,4-9,9]
chi2=21,57
p=3,4e-06

№ 1

0,45

0,55

0,21(45)

0,48(102)

0,3 (65)

p=0,671

№ 2

0,2

0,8

0,04 (1)

0,32(8)

0,64 (16)

p=1,00

Полиморфный локус G1258А гена MTHFD

 

G

A

G/G

G/A

A/A

 

для аллеля А

OR =4

[1,9-8,6]
chi2=14,04
p=0,00018

№ 1

0,57

0,42

0,34(18)

0,47(25)

0,19(10)

p=0,801

№ 2

0,25

0,75

0,13(3)

0,25(6)

0,62 (15)

p=0,102

Полиморфный локус 675 4G/5G гена PAI

 

5G

4G

5G/5G

4G/5G

4G/4G

 

дляаллеля 4G

OR =2,6
[1,3-5,4]
chi2=7,29,
p=0,007

№ 1

0,52

0,47

0,24 (19)

0,57(46)

0,18 (15)

p=0,171

№ 2

0,29

0,7

0,13(3)

0,32 (7)

0,54 (12)

p=0,268

Полиморфный локус T1565C гена GPIIIa

 

Т

С

Т/Т

С/Т

С/С

 

для аллеля C

OR =2,7
chi2=4,2
p=0,04

№ 1

0,89

0,11

0,82(86)

0,15(16)

0,03(3)

p=0,079

№ 2

0,73

0,27

0,63(7)

0,18(2)

0,18(2)

p=0,108

Примечание: * критерий χ² использован для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга.Распределение частот генотипов соответствует закону Харди-Вайнберга во всех группах для всех исследуемых генов   

По данным нашего исследования,распространенностьлейденской мутации в гене FV у женщин репродуктивного возраста, проживающих на территории г. Новосибирска и Новосибирской области, в целом по группе составила 3,3 % и практически не отличается от частоты встречаемости данной мутации в европейской популяции.У женщин без клинических проявлений тромбофилии процент встречаемости полиморфизма FVбыл равен 1,97. В группе больных с верифицированным диагнозом тромбоз глубоких вен (ТГВ), ишемический инсульт, тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) частота гетерозиготного варианта гена FV составила 4,7 %, и ни в одном случае не была зарегистрирована гомозиготная форма гена. Этот факт указывает на некоторые отличияот частотмутаций данного гена у пациенток европейской популяции с тромботическими эпизодами в анамнезе. Так, по данным[1] частота гомозиготной формы мутации FVLeidenпри тромбозах выявлена в 17,6 %обследованных и гетерозиготной - в 35,3 %. Заслуживающим внимания, на наш взгляд,является факт отсутствиямутации в гене протромбина G20210Aу обследованных намипациенток с верифицированным диагнозом тромбозов. Известно, что этамутация достаточно редко встречается в популяции (1 - 4 %), но среди больных с венозными тромбозами достигает 17-20 % [1, 2, 9]. Мы не выявили также различий в распространенности мутаций в гене протромбина (FII), связанной с заменой GAсреди женщин практически здоровых и пациенток с тромботическими осложнениями. В целом для общего числаобследованных частота гетерозиготного вариантаGA 20210 гена протромбина составила 1,75. Гомозиготная форма не была выявлена ни у одной из обследованных женщин. У больных с эпизодами тромбозов (2-ая группа) в 100 % случаев регистрировался «дикий» тип гена (вариант G/G).

Работами многочисленных авторов показано, что ведущими причинами в генезе венозных тромбоэмболий являются мутационные повреждения гена фактора V свертывания крови (лейденская мутация) и гена протромбина (аллель 20210А). Риск развития тромботических осложнений особенно высок при сочетании мутаций в гене протромбина GA 20210 с FV (фактор Лейдена) [3,10].

Частоту «мутированных»генов FV и FII в общей структуре полиморфизмов у женщин с тромбозами, выявленную в нашем исследовании, можно было бы рассматривать как показатель достаточноблагоприятной ситуации в плане распространенности наследственнойтромбофилии среди женщин, проживающих в Западно-Сибирском регионе. Однако,на наличие генетически обусловленной тромбофилии указывают находки при скрининге более широкого спектра генов системы гемостаза и фолатного цикла(см. табл.).

Изучение генов системы фолатного цикла было обусловлено их высокой патогенетической значимостью в развитии тромбофилии. Признанным фактором риска развитиясердечно-сосудистых заболеваний и фактором риска развития венозных и артериальных тромбозов на протяжении ряда десятилетий считается гипергомоцистеинемия.В литературе приводятся данные об ассоциации тромбозов с мутацией гена MTHFRС677, приводящей к снижению активности MTHFR и накоплению ГЦ[2,12].

Как видно из Таблицы,среди женщин Западно-Сибирского региона выявлен довольно высокий процент мутаций вэтих генах. Мутации в генеМТГФР С677Т выявлены в 51,4 %, при этом распределение вариантов гена не показало достоверныхразличий для 1-ой и 2-ой групп.В то же время необходимо отметить, чтоу женщин 2-ой группыс тромботическими заболеваниями в55,6 % случаевотсутствовалдефект в гене МТГФР С677Т. Другая ситуациявыявлена при анализе встречаемостимутаций в генах метилентетрагидрофолатдегидрогеназы - MTHFD (1958А->G), метионин синтазыи метионин синтазы-редуктазыMTRR (66A>G). В группе женщин с тромбозами различной локализации редкие аллели этих генов обнаруживались достоверно чаще. Аллель 1258А гена MTHFD является фактором риска развития тромбоза, при его носительстве риск возрастает в 4 раза (OR =4,0 C.I. [1,9-8,6] p=0,00018). При носительстве аллеля 66G гена MTRR также повышается риск тромбоза (OR =4,8 С.I. [2.4-9.9] chi2=21,57 p=3,4e-06) (табл.).

Существуетмнение [12],чтонарушение любого из звеньев как метионинового, так и фолатного цикла может привести к повышению общего содержания гомоцистеина в плазме крови.Мы полагаемвысоко вероятным, что дефект гена MTHFD, который кодирует фермент, осуществляющий превращение одноуглеродных производных тетрагидрофолата и участвует в синтезе метионина, тимидилатаи пурина в сочетании с мутациями в генах MTR и MTRR, которые кодируют аминокислотную последовательностьферментов, участвующихвпроцессах реметилирования гомоцистеина в метионин,может приводить к гипергомоцистеинемии и служить фактором риска тромботических заболеваний у молодых пациенток даже при нормальном (диком) типе гена MTHFR(С677Т).

Наряду с высокой частотой встречаемости гомозиготных вариантов генов MTHFD, MTRR во 2-ойгруппе женщин, как правило, имело место сочетание гомо - и гетерозиготных мутаций нескольких геновфолатного цикла.Комбинация из трех генных полиморфизмов встретилась у 84,2 % больных, присутствие гомозиготного варианта одного или двух полиморфизмоввыявлено в этой группепациенток в 95,3 % случаев. По-видимому, именносочетания генетических полиморфизмовявляются серьезнымфактором риска нарушений в работе ферментов фолатного цикла, приводящих к избыточному накоплению гомоцистеина в плазме крови.

Особого внимания заслуживаетобнаруженная нами комбинация мутированных генов фолатного цикла с наличием полиморфной замены 675 5G -> 4Gгена ингибитора активатора плазминогена (PAI1). Носительствоаллеля 4G, который сопровождается повышенной экспрессией гена и приводит к повышению в крови PAI-1, зарегистрирован нами в 86 % случаев обследованных пациентов. У носителей аллеля 4G675 гена PAI-1 риск тромбозов повышен в 2,6 раз (OR =2,6 С.I.
[1,3-5,4] chi2=7,29 p=0,007). Гомозиготная форма 4G/4Gгена PAI1 во 2-ой группе
в 3 раза превышала таковую по сравнению с женщинами без проявлений признаков тромбофилии.Если в первой группе обследованных женщин гомозиготнаяформа выявлена в 17,5 % случаев, то в группе с тромбозамиэтот процент составил 54,5. В 45 % случаев имело место сочетание полиморфизма PAI-1 сприсутствием полиморфного варианта тканевого активатора плазминогена (PLAT- 7351 С->Т,чтотакже является предиктом снижения высвобождения тканевого активатора плазминогена, приводящим к неэффективному фибринолизу.

Особенностьюженщин репродуктивного возраста с развившимся тромбозом в молодом возрасте явилось наличие мультигенного характера тромбофилии в 100  % случаев. Очевидным было и преобладание сочетаний гомозиготных форм исследуемых генов (MTHFD (1958А->G), MTRR (66A>G), PAI1 (675 5G ->4G ), GРIIIa (1565 Т- С), NSO3 (Glu298Asp) в этой группе, что рассматривается нами в качестве предиктовскрытых форм тромбофилии.Так, замена Т на С в 1565 положении гена GРIIIa приводит к аминокислотной замене лейцина (Leu) на пролин (Pro) в 33-м положении. Тромбоциты, несущие GРIIIa Pro33, имеют более низкий порог активации, то есть они более склонны к агрегации. У носителей 1565C гена GPIIIa риск тромбозов повышен в 2,7 раз (OR =2,7 chi2=4,2 p=0,04).

Комбинации из2-х, 3-х и более«мутированных» генов (чаще гетерозиготных форм) имели место иуженщин без клинических признаков тромбофилии (1-ая группа). Такие находки, даже без изменений в генах FVи FII, по нашему мнению, должны настораживать врача, поскольку при определенных условиях (беременность, операционное вмешательство, использование КОК и ГЗТ) может иметь место реализациипредрасположенности к тромбозам впатологический процесс.Эти пациенты должны быть включены в группы риска развития тромботических осложнений, хотя на момент обследования данных за наличие тромбинемии у нихне выявляется.

Заключение

Несмотря на то, что в мировой практике молекулярно-генетический анализ не используется в качестве скринингового, действительность показывает, чтовопрос о приемлемости контрацепции и заместительной гормональной терапии не может решаться без генетического тестирования пациенток с целью выявления наследственной предрасположенностью к тромбозам. Нами показано, что эти вопросы не могут быть решены и при тестировании ограниченного числа наиболее изученных генов, считающихся безусловными и строгими маркерами наследственной тромбофилии (F.V, FП, MTHFR- С677Т).

Врачи-гинекологи, флебологидолжны иметь данные о дефектах в генах, контролирующих различные звенья сложной системы гемостаза и фолатного цикла, поскольку это может быть основой для выявления скрытых форм тромбофилии у женщин репродуктивного возраста, а также предупреждения тромбозов и купирования повторных эпизодов заболевания. Применение молекулярно-биологических методов дает возможность определять значимые факторы, оказывающие влияние на развитие патологического процесса, выявлять патологию на стадии предболезни, осуществлять поиск патогенетически обоснованных методов профилактики и лечения и, тем самым, снижать риск тромботических осложнений. Эффективность диагностики и лечения во многом зависит от понимания врачом возможностей использования данных генетического анализа для выяснения механизмов развития наследственной тромбофилии.

Список литературы

  1. Баранов В.С. Генетические основы предрасположенности к некоторым частым мультифакториальным заболеваниям// Медицинская генетика.2004.Т. 3.С. 102-112.
  2. Гипергомоцистеинемия как самостоятельный фактор риска поражений и тромбирования кровеносных смосудов / З.С. Баркаган [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. 2002.№ 1.С. 65-71.
  3. Вавилова Т.В. Гемостазиология в клинической практике. Пособие для врачей.СПб, 2005.91 с.
  4. Роль генетической тромбофилии в структуре тромботических осложнений у гинекологических больных высокой группы риска в периоперационном периоде / А.Д. Макацария [и др.]// Мед.науки. 2008.№ 1. С. 7.
  5. Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики. СПб.: Изд-во «ФормаТ», 2006. 209 с.
  6. Выявление генетических факторов риска развития сердечно-сосудистой патологии в Северо-Западном регионе России / С.Н. Пчелина [и др.] // Медицинская генетика. 2005. Т. 4. № 6. С. 256.
  7. Генетические факторы риска развития сердечно-сосудистых заболеваний / С.Н.Пчелина[и др.]// Пособие для врачей. СПб, 2006.С. 25.
  8. Стойко Ю.М., Замятина А.В. Патогенетические аспекты консервативной терапии хронической венозной недостаточности у беременных//ConsiliumMedicum 2007/9:6:44-47.
  9. Роль полиморфных вариантов некоторых генов, участвующих в развитии эндотелиальной дисфункции, в формировании гестоза/ Е.А. Трифонова [и др.]//Молекул.мед.2009. № 1.С. 3-9.
  10. Генетические факторы риска развития тромбозов в молодом возрасте / А.М. Шейдина [и др.]//Вопросы современной педиатрии. 2005. Vol. 4,№ 1.P. 42-46.
  11. Genetic variation in coagulation and fibrinolytic proteins and their relation with acute myocardial infarction / S.M.Boekholdt[etal.]// Circulation.2001,Vol. 104.P. 3063-3068.
  12. Homocysteine inhibits inactivation of factor Va by activated protein C /A.Undas [etal.]// J.Biol.Chem.2001,Vol. 276.P.4389-4397.
  13. http://ihg.gsf.de/ihg/index_engl.html.( Институт генетики человека.Мюнхен, Германия).