Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Изучение взаимодействия патогенных грибов с устойчивыми видами (видами-нехозяевами) необходимо для развития теории иммунитета растений. Кроме того, выявление комплекса механизмов, стабильно защищающих виды-нехозяева от болезней, важно для создания культурных растений с длительной устойчивостью к болезням. Вид Triticum timopheevii Zhuk. считается эталоном устойчивости к грибным заболеваниям и используется в качестве донора генов для селекции пшеницы [1]. Однако механизмы его устойчивости к болезням, включая бурую ржавчину, вызываемую Puccinia triticina Erikss., мало исследованы.

В последние десятилетия большое внимание уделяется изучению роли активных форм кислорода (АФК) в защите растений. Установлено, что окислительный взрыв – универсальная реакция на стрессы, вызываемые действием абиотических и биотических факторов [10]. В устойчивости растений к болезням наиболее изучено значение двух форм АФК – супероксид-аниона О2- и перекиси водорода Н2О2 . Основная часть исследований была проведена на растениях класса Двудольные, а также клеточных культурах разных видов. Доказано, что генерация АФК происходит при заражении устойчивых растений авирулентными штаммами микроорганизмов или обработке продуктами их обмена – элиситорами защитных реакций. АФК оказывают многообразное действие на патогенез: разрушают клетки паразитов; запускают сигнальную трансдукцию, приводящую к активации набора защитных механизмов; участвуют в реализации реакции сверхчувствительности (СВЧ) и в укреплении клеточных стенок [10, 11]. Как правило, окислительный взрыв протекает двухэтапно, первый пик возникает через 5–60 мин после узнавания патогенов элиситоров, а второй – через несколько суток и связан с синтезом белков de novo [9, 10]. Исследования роли окислительного взрыва во взаимодействиях злаков с ржавчинными грибами немногочисленны. На модели «возбудитель желтой ржавчины P. Striiformis f. sp. tritici – мягкая пшеница» показано, что в устойчивом сорте, в сравнении с восприимчивым, была значительно повышена активность ферментов про/антиоксидантной системы на стадии образования пустул [8]. На этой же модели продемонстрировано, что устойчивость сорта была связана с накоплением в клетках О2- и Н2О2, а также развитием реакции СВЧ [15]. В то же время генерация О2- имела решающее значение в устойчивости линий пшеницы с интрогрессированными генами к P. triticina [4].

Целью работы было исследование значения генерации супероксид-аниона и перекиси водорода в устойчивости образцов T. timopheevii к бурой ржавчине.

Материалы и методы исследований

Растительный материал. Образцы вида Triticum timopheevii Zhuk. к-30920 и к-38555 были получены из коллекции Всероссийского института растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР). Для сравнения результатов в опытах использовали восприимчивый к бурой ржавчине сорт яровой мягкой пшеницы T. Aestivum L. Памяти Азиева. Исследования проводили на 20-дневных растениях в стадии 2-х листьев, выращенных в почве при 16-часовом освещении.

Заражение и культивирование листьев, оценка типа реакции. Урединиоспоры популяции P. triticina были собраны на сортах мягкой пшеницы в Западной Сибири (г. Омск) в 2013 г. Инокулюм для экспериментов размножали на растениях сорта Памяти Азиева. Эксперименты осуществляли на отрезках листьев, их жизнеспособность поддерживали 0,004 % раствором бензимидазола [2]. Инокуляцию проводили суспензией урединиоспор P. triticina (10–12 тыс. спор/ мл). Контрольные растения обрабатывали дистиллированной водой.

Тип реакции растений на заражение определяли через 10 сут после инокуляции (п/ин) при появлении пустул на листьях. Для оценки применяли 5-балльную шкалу: 0 – иммунитет, без симптомов; 0; – мелкие некротические или хлоротические пятна; 1 – мелкие пустулы с зонами некроза; 2 – мелкие и средние пустулы с большими зонами некроза; 3 – пустулы среднего размера с зонами хлороза; 4 – крупные пустулы. Растения с типом реакции 0–2 балла считали устойчивыми, 3–4 балла – восприимчивыми [13]. Оценку проводили на 20 растениях образцов T. timopheevii и 5 T. aestivum в двух повторностях.

Определение содержания супероксид-аниона и перекиси водорода. Содержание О2- оценивали акцепторным методом по окислению адреналина и превращению его в адренохром [7]. Оптическую плотность растворов измеряли при 490 нм на спектрофотометре СФ-26. Содержание Н2О2 в листьях определяли по превращению ксиленолового оранжевого, оптическую плотность раствора определяли при 560 нм [9]. Анализы проводили через 0,5; 1; 2; 3; 5; 10 сут п/ин, в 2-х биологических (по отрезкам 10 листьев) и 3-х аналитических повторностях.

Локализация АФК в тканях и цитологические исследования. АФК определяли путем витального окрашивания листьев: О2- – 0,1 %-ым водным раствором нитросинего тетразолия (НСТ) («Acros», США); Н2О2 – 0,02 %-ым водным 3,3’-диамино-бензидин тетрахлоридом (ДАБ) («Sigma», США) с помощью вакуум-инфильтрации листьев. НСТ образовывал синее, а ДАБ – вишневое соединение [3, 11]. Через 30 мин материал фиксировали в лактофеноле. Для выявления структур гриба те же листья окрашивали 1 %-ым анилиновым синим («Sigma», США) в лактофеноле, затем дифференцировали окраску насыщенным водным раствором хлоралгидрата («Acros», США) [3]. Цитологические исследования проводили на 10 растениях каждого образца T. timopheevii, а также 5 растениях мягкой пшеницы с помощью светового микроскопа Axioscop («Carl Zeiss», ФРГ). Размеры колоний и пустул измеряли с помощью окуляр-микрометра, площадь вычисляли по формуле площади эллипса. В статье приведены средние значения по всем данным и их стандартные ошибки.

Результаты исследования и их обсуждение

На листьях восприимчивого сорта T. aestivum развивались крупные пустулы (балл 4), а образцы T. timopheevii в целом проявили устойчивость к ржавчине. В более устойчивом образце к-38555 75 % растений были иммунны (балл 0, 0;), 25 % – устойчивы (балл 1). В образце к-30920 наблюдался больший полиморфизм растений: 30 % были иммунны (балл 0, 0;), 55 % – устойчивы (балл 1–2), 15 % – восприимчивы (балл 3). Пустулы на листьях к-38555 и к-30920 были существенно меньше, чем на мягкой пшенице (в 11,5 и 7,5 раза соответственно) (таблица).

Биохимические исследования показали фоновый уровень супероксид-аниона и перекиси водорода (1,6–1,9 мкмоль/г сырой массы листьев) в контрольных незараженных листьях всех образцов, их содержание достоверно снижалось к концу эксперимента (рис. 1). В зараженных листьях T. aestivum О2- оставался на исходном уровне, а содержание Н2О2 увеличивалось на стадии образования пустул. В листьях образцов T. timopheevii усиление генерации О2- отмечено через 0,5–2 сут п/ин, оно было более выражено в образце к-38555, позже содержание О2- снижалось до исходного уровня. Повышение содержания Н2О2 установлено через 3 сут п/ин (в 1,5–1,6 раза по сравнению с исходным), затем в более устойчивом образце к-38555 ее уровень оставался стабильным, а в к-30920 повышался.

Биотрофный паразит P. triticina образует набор специализированных инфекционных структур для взаимодействия с растением на клеточном уровне. Цитологические исследования показали, что на листьях мягкой пшеницы все споры образовывали ростковые трубки, а затем аппрессории на устьицах через 0,5 сут п/ин. Цитоплазма аппрессориев перемещалась в подустьичные везикулы, оставляя на устьицах пустые оболочки (рис. 2, а). Позже в мезофилле формировались инфекционные гифы, на их концах образовывались материнские клетки гаусторий (МКГ), а через 1 сут п/ин в клетки растений проникали гаустории, необходимые для питания гриба. Гифы имели плотную цитоплазму, образовывали много МКГ и гаусторий (рис. 2, б, таблица). Все колонии сформировали крупные пустулы через 10 сут п/ин (рис. 2, в).

На двух образцах T. timopheevii выявлены 5 вариантов взаимодействия P. triticina с растениями, их соотношение отличалось на разных растениях (рис. 3, а, б):

I – часть спор прекращала развитие на стадии ростковых трубок (рис. 2, г);

II – значительная доля инокулюма (на к-38555 5–55 %, на к-30920 – 5–30 %) погибала на стадии аппрессория, реже – подустьичной везикулы (рис. 2, д);

III – отмирание колоний происходило после внедрения 2–3 гаусторий в мезофилльные клетки и сопровождалось реакцией СВЧ. Сначала происходил коллапс клеток, а через 1 сут их цитоплазма разрушалась и интенсивно окрашивалась анилиновым синим (рис. 2, е);

IV – гибель мелких колоний (в среднем 54 % на к-38555 и 48 % на к-30920) происходила через 3–5 сут п/ин без реакции СВЧ. Колонии по размерам распадались на 3 группы, установлена высокая корреляция между размерами колоний и числом гаусторий в них (r = 0,85). Клетки гриба были слабо окрашены, что свидетельствует об их вакуолизации (рис. 2, ж). После абортации отмечены отложения на стенках, контактировавших с грибом (таблица);

V – колонии формировали пустулы. На устойчивых растениях окраска клеток растения в зоне колоний усиливалась через 5 сут п/ин, и к моменту спороношения они отмирали, образуя визуальные зоны некроза вокруг пустул, одновременно появлялись отложения на клеточных стенках. На восприимчивых растениях образца к-30920 образовывались пустулы большего размера без цитологических признаков несовместимости.

Для уточнения роли АФК в патогенезе была изучена локализация О2- и Н2О2 в тканях. Выявлено присутствие О2- и Н2О2 в поврежденных клетках на срезах листьев как контрольных, так и инфицированных листьев всех образцов, остальные части контрольных растений не окрашивались. Вероятно, накопление АФК связано с травматической реакцией, что объясняет фоновый уровень О2- и Н2О2 в листьях. На зараженных листьях мягкой пшеницы НСТ окрашивал только гранулярные структуры в аппрессориях через 0,5 сут п/ин, что, очевидно, связано с дегидрогеназной активностью митохондрий гриба (рис. 2, з). В листьях T. timopheevii локализация О2- зависела от варианта взаимодействия с грибом. В варианте I окрашивались только митохондрии в кончиках ростковых трубок. В варианте II отмечено интенсивное накопление О2- в цитоплазме аппрессориев (реже подустьичных везикул) через 0,5 сут п/ин, проникновение в ткани ингибировалось (рис. 2, и). Цитоплазма замыкающих клеток устьиц не окрашивалась, что свидетельствует об экстраклеточной генерации О2-, оно было сильнее выражено у образца к-38555. В варианте III О2- накапливался в мезофилльных клетках, погибших в результате реакции СВЧ после внедрения гаусторий через 1–2 сут п/ин (рис. 2, к), но позже исчезал. В остальных вариантах О2- не обнаружен.

В инфицированных листьях мягкой пшеницы слабое накопление Н2О2 обнаружено под пустулами через 10 сут п/ин. В листьях T. timopheevii высокое содержание Н2О2 отмечено в цитоплазме клеток, отмерших в результате реакции СВЧ через 3 сут п/ин (вариант III) (рис. 2, л), зоны некроза и локализации Н2О2 совпадали. Через 5 сут п/ин слабое увеличение Н2О2 выявлено на стенках клеток в зоне абортивных колоний без реакции СВЧ (вариант IV). В зоне небольших колоний с мелкими пустулами, окруженными некрозом (вариант V), отмечено повышение содержания Н2О2 в цитоплазме и на клеточных стенках через 5–10 сут п/ин (рис. 2, м). На восприимчивых растениях T. timopheevii существенного накопления АФК в течение патогенеза не установлено.

Таким образом, в устойчивых растениях T. timopheevii выявлено повышение уровня АФК на разных этапах патогенеза. Оно коррелировало с отмиранием аппрессориев, реакцией СВЧ, а также ограничением размеров колоний и пустул на поздних этапах патогенеза (варианты II, III, V). Не отмечено взаимосвязи между АФК и подавлением развития на поверхности растений, а также абортацией колоний с малым числом гаусторий (варианты I и IV).

Результат патологического процесса зависит от взаимодействия двух организмов, при этом имеют значение как особенности патогена, так и интенсивность защитных реакций растений. Полиморфизм растений внутри образцов может быть связан с генетической неоднородностью T. timopheevii. Этот вид мало окультурен и возделывался в форме стародавних сортов-популяций в Закавказье [1]. Кроме того, причиной возникновения выявленных вариантов взаимодействия могут быть различия по вирулентности между клонами P. triticina. Это предположение подтверждается тем, что в Западной Сибири отмечена потеря устойчивости набора интрогрессивных линий с генами T. timopheevii [6].

Нами впервые изучена генерация АФК при развитии бурой ржавчины на растениях устойчивого вида T. timopheevii. Полученные результаты подтверждают сложившееся представление о двухфазном характере окислительного взрыва, однако новым фактом является то, что первый пик был связан с накоплением О2-, а второй – Н2О2. Ранее при заражении устойчивого сорта мягкой пшеницы P. striiformis f. sp. tritici было показано одновременное накопление О2- и Н2О2 в пораженных клетках, при этом реакция СВЧ развивалась медленно (3 сут вместо 1 сут в наших экспериментах) [15]. На этой же модели получены данные о повышенной активности супероксиддисмутазы, преобразующей О2- в Н2О2, а также ферментов, способных образовывать и утилизировать Н2О2 (диаминоксидазы, полиаминоксидазы, пероксидазы) в устойчивом сорте [8]. При взаимодействии возбудителя ржавчины Uromyces vignae Barclay с иммунным сортом вигны О2- не выявлен, но отмечено накопление Н2О2 и повышение активности пероксидаз в клетках, погибших в результате реакции СВЧ [11]. Можно предположить, что динамика генерации разных форм АФК связана с индивидуальными особенностями партнеров или активностью элементов про/антиоксидантной системы растений.

Выявленные нами варианты взаимодействия P. triticina с растениями T. timopheevii позволяют определить критические моменты патогенеза и оценить влияние АФК на его результаты. Подавление развития грибов до внедрения в ткани (прегаусториальная устойчивость) или после проникновения в единичные клетки растения, отмирающие в результате реакции СВЧ, считается характерным проявлением устойчивости видов-нехозяев. На основании изучения особенностей реакций нехозяев было постулировано, что стабильная защита может определяться механизмами, не связанными с реакцией СВЧ [12]. В целом взаимодействие P. triticina с T. timopheevii соответствуют этим критериям.

Ранее было показано, что образование О2- замыкающими клетками устьиц и накопление его в аппрессориях предотвращало проникновение P. triticina в ткани видов-нехозяев (овса и ячменя), а также линий пшеницы с генами рода Agropyron Lr19, Lr38 [4]. Этот механизм был в меньшей степени значим у T. timopheevii определял гибель только части аппрессориев. Известно, что окислительный взрыв запускает реакцию СВЧ, при этом скорость разрушения клеток зависит от содержания АФК [4]. Вероятно, этот механизм имел ограниченное значение для T. timopheevii, потому что у 20 % растений СВЧ не установлена, а в остальных была связана с 12–20 % взаимодействий. На значительной части (40 %) растений T. timopheevii гриб образовывал пустулы, окруженные зонами отмерших клеток. Вероятно, генерация Н2О2 в зоне таких колоний была связана со вторым пиком окислительного взрыва, а также действием пероксидаз, участвующих в окислении веществ и укреплении стенок с помощью лигнина и сшивок структурных белков [8]. Размеры таких колоний и пустул были существенно меньше, чем на восприимчивых растениях T. aestivum и T. timopheevii, поэтому возможно ингибирующее влияние АФК и индуцируемых ими соединений на развитие патогена и спорогенез.

Для совместимого взаимодействия паразитических грибов с растениями важно не только преодоление механизмов устойчивости, но и установление эффективных трофических связей. Нами впервые показано, что на всех растениях T. timopheevii значительная часть колоний (в среднем около ½ от нанесенного инокулюма) погибала независимо от накопления АФК и реакции СВЧ. Для таких колоний было характерно малое число гаусторий и сильная вакуолизация клеток. Сходный способ ингибирования развития P. triticina был обнаружен и в линии пшеницы с геном Lr23 интрогрессированным от редкого вида T. turgidum [5].

В настоящее время известно, что паразитические грибы воспринимают особенности поверхности, физические и химические свойства растений в качестве стимулов для развития, а при недостаточной стимуляции их морфогенез нарушается. На примере возбудителей ржавчины бобовых культур U. fabae и U. appendiculatus показано, что полисахариды из клеточных стенок и летучие соединения хозяев (нонаналь, деканол и гексенилацетат) усиливают, а фарнезилацетат интенсивно подавляет образование материнских клеток гаусторий [14]. Можно предположить существование у T. timopheevii защитного механизма, нарушающего образование и функционирование гаусторий, следствием чего было нарушение питания и гибель от голодания значительной доли колоний на ранних этапах развития.

Таким образом, полученные результаты показали, что АФК в тканях T. timopheevii участвуют в реализации реакции СВЧ, а также приводят к гибели или ограничением развития P. triticina при внедрении в ткани, проникновении гаусторий в клетки, а также на поздних этапах роста колоний и спорогенезе. Возможно, T. timopheevii обладает дополнительным защитным механизмом, ингибирующим образование гаусторий и нарушающим питание P. triticina.

Барайщук Г.В., д.б.н., профессор, профессор ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина, г. Омск;

Синдирева А.В., д.б.н., профессор ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина, г. Омск.

Работа поступила в редакцию 12.02.2015.