Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Дзюба Е.В. 1 Суханова Е.В. 1 Деникина Н.Н. 1 Белькова Н.Л. 1, 2

---

1 ФГБУН «Лимнологический институт» Сибирского отделения РАН

2 ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет»

Значительное влияние на состав бактериального сообщества кишечника рыб оказывают вид и биохимические характеристики кормовых объектов, следовательно, качественный и количественный состав микробиоценоза рыб с различным типом питания отличается. Всеядные виды рыб обладают большим микробным разнообразием, чем хищные. Байкальский омуль Coregonus migratorius и черный байкальский хариус Thymallus baicalensis отличаются по пищевым стратегиям и принадлежат к разным трофическим сетям озера Байкал. Цель исследования – сопоставить генетическое разнообразие микробиоценозов кишечной микрофлоры черного байкальского хариуса и байкальского омуля. Материалом для работы послужили черный байкальский хариус и байкальский омуль. Молекулярно-генетический анализ фрагментов кишечника рыб проводили согласно адаптированным ранее методикам. Сравнительный анализ полученных последовательностей проводили с помощью пакета программ FASTA. В составе кишечных микробиоценозов рыб определены аллохтонные (строгие аэробы, представители филы Proteobacteria: Azospirillum, Bradyrhizobium, Comamonas, Collimonas, Pseudomonas, Pseudoalteromonas, Quatrionicoccus, Stenotrophomonas, некультивируемые бактерии фил Bacteroidetes и Actinobacteria) и автохтонные представители (микроаэрофилы и анаэробы: Acinetobacter, Aeromonas, Brevinema, Caulobacter, Clostridium, Deefgea, Delftia, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Mycoplasma, Plesiomonas, Pseudomonas, Salmonella, Spironema, Sphingomonas и некультивируемые Deltaproteobacteria). Пищевые спектры рыб достаточно широки, но качественный состав кормовых объектов, составляющих основу их питания, различен. Черный байкальский хариус показал большее генетическое разнообразие кишечной микрофлоры, чем байкальский омуль.

Статья в формате PDF

348 KB

микробиоценоз

генетическое разнообразие

Thymallus baicalensis

Coregonus migratorius

пищевые стратегии

1. Белькова Н.Л. Молекулярно-генетические методы анализа микробных сообществ // Разнообразие микробных сообществ внутренних водоёмов России: учебно-методическое пособие. – Ярославль: Принтхаус, 2009. – С. 53–63.

2. Белькова Н.Л., Дзюба Е.В., Суханова Е.В., Ханаева Т.А. Адаптация методов молекулярно-генетического анализа для изучения микроорганизмов, ассоциированных с рыбами // Биология внутренних вод. – 2008. – № 2. – С. 91–94.

3. Книжин И.Б., Вайс С.Д., Сушник С. Хариусы бассейна озера Байкал (Thymallus, Thymallidae): разнообразие форм и их таксономический статус // Вопр. Ихтиологии. – 2006. – Т. 46. – № 4. – С. 442–459.

4. Кузьмина В.В. Физиолого-биохимические основы экзотрофии рыб. – М.: Наука, 2005. – 300 с.

5. Максимова Н.В., Дзюба Е.В. Роль моллюсков в питании черного байкальского хариуса (Thymallus arcticus baicalensis) // Четвертая Верещагинская байкальская конференция: тезисы докладов и стендовых сообщений. – Иркутск: Изд-во Ин-та географии СО РАН, 2005. – С. 119–120.

6. Тугарина П.Я., Купчинская Е.С. Питание и пищевые взаимоотношения рыб Байкало-Ангарского бассейна. – Новосибирск: Наука, 1977. – 103 с.

7. Тугарина П.Я. Хариусы Байкала. – Новосибирск: Наука, 1981. – 280 с.

8. Jørgensen N.O., Brandt K.K., Nybroe O., Hansen M. Delftia lacustris sp. nov., a peptidoglycan-degrading bacterium from fresh water, and emended description of Delftia tsuruhatensis as a peptidoglycan-degrading bacterium // Int J Syst Evol Microbiol. – 2009. – Vol. 59. – P. 2195–2199.

9. Kim D.-H., Brunt J., Austin B. Microbial diversity of intestinal contents and mucus in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // J. Appl. Microbiol. – 2007. – Vol. 102. – P. 1654–1664.

10. Ringø E., Sperstad S., Myklebust R., Mayhew T.M., Olsen R.E. The effect of dietary inulin on aerobic bacteria associated with hindgut of Arctic charr (Salvelinus alpinus L.) // Aquaculture Res. – 2006. – Vol. 37. – № 9. – P. 891–897.

11. Smirnov V.V. Intraspecific structure of Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) // Pol. Arch. Hydrobiol. – 1992. – Vol. 39. – № 3–4. – P. 325-333.

12. Ward N.L., Steven B., Penn K., Methé B.A., Detrich W.H. Characterization of the intestinal microbiota of two Antarctic notothenioid fish species // Extremophiles. – 2009. – Vol. 13. – P. 679–685.

13. Wu X., Sun J., Zhang W., Wen B. Purification and antigenic characteristics of a rickettsia-like organism from the oyster Crassostrea ariakensis // Dis. Aquat. Org. – 2005. – Vol. 67. – P. 149–154.

Значительное влияние на микробиоценоз кишечника рыб оказывают вид и биохимические характеристики кормовых объектов [10], в связи с этим качественный и количественный состав составляющих его микроорганизмов различен у рыб с различным типом питания [4]. Всеядные виды рыб обладают большим микробным разнообразием, чем хищные [12].

Байкальский омуль Coregonus migratorius (Georgi, 1775) и черный байкальский хариус Thymallus baicalensis отличаются по пищевым стратегиям и принадлежат к разным (пелагической и бентической) трофическим сетям озера Байкал. Известны три морфоэкологические группы (МЭГ) байкальского омуля (пелагическая, прибрежная и придонно-глубоководная), занимающие различные пищевые ниши. В зимне-весенний период омуль всех МЭГ имеет сходные пищевые спектры (Epischura baicalensis и Macrohectopus branickii, молодь рыб, донные амфиподы), т.к. обитает в придонных слоях склоновой зоны озера. В мае-июне омуль расходится по различным биотопам: придонно-глубоководный остается в придонных слоях воды на значительных глубинах (сезонные изменения рациона не выражены); пелагический нагуливается в пелагиали и в придонных слоях воды (сезонные изменения незначительны); омуль прибрежной МЭГ обитает в прибрежной зоне озера (кормовая база крайне изменчива сезонно и территориально) [11].

Черный байкальский хариус преимущественно ведет образ жизни, связанный с речными условиями. В течение всего года он образует плотные скопления в литорали Байкала в предустьевых участках притоков, в которых происходит его нерест и частично нагул [3]. По характеру питания черного байкальского хариуса можно считать эврифагом, т.к. спектр потребляемых им организмов очень широк и включает в себя как животных бентоса (личинок ручейников, амфипод, гастропод и др.), так и имаго амфибиотических насекомых [6, 7].

Цель настоящего исследования – провести сравнительный анализ генетического разнообразия кишечных микробиоценозов черного байкальского хариуса и байкальского омуля, лососевидных рыб с разной пищевой стратегией и распределением в озере.

Материал и методы исследования

Материалом для работы послужили два вида лососевидных рыб озера Байкал: черный байкальский хариус (27 экз.) и байкальский омуль (67 экз.). Сборы материалов по акватории озера Байкал проводили в период открытой воды (июнь и сентябрь) разноглубинным тралом РК-15/30. Для сбора черного байкальского хариуса использовали жаберные сети (ячея 14–24 мм), которые выставлялись на глубинах 0,5–8,0 м в мае 2008 г. в районе б. Песчаная (южная котловина озера Байкал). Непосредственно после отлова в лабораторных условиях взяты фрагменты кишечного тракта (КТ) рыб.

Молекулярно-генетический анализ проводили согласно адаптированным ранее методикам [2]. Структуру микробных сообществ кишечной микробиоты байкальского омуля трех МЭГ и черного байкальского хариуса исследовали с помощью групп-специфичной ПЦР [1]. Ампликоны, полученные индивидуально для каждой особи на консервативных бактериальных праймерах [2], объединяли для анализируемых групп и суммарные образцы, лигировали с использованием набора GeneJETTM PCR Cloning Kit (Fermentas, Литва). Все выросшие колонии анализировали методом ПЦР с праймерами, рекомендованными производителем (Fermentas, Литва). Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI310A (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) в центре коллективного пользования «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). Полученные последовательности проанализировали с помощью пакета программ FASTA (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/), на наличие химерных структур проверили программой CHECK CHIMERA (http://rdp8.cme.msu.edu/cgis/chimera) и зарегистрировали в международной EMBL-базе данных под номерами: FR799652, FR799653, FR799680, FR799684, HE565982–HE566014, HE566026–HE566038, HE566041–HE566044, HE584724–HE584729, HE589594–HE589602.

Результаты исследования и их обсуждение

Кишечная микробиота рыб, включающая аэробных, факультативно-анаэробных и облигатных анаэробных бактерий, может быть классифицирована как автохтонная, или собственная (микроорганизмы, колонизирующие эпителий кишечника хозяина), и аллохтонная, или транзиторная. Состав и структура микробного сообщества зависят от экологических условий местообитания и пищевых стратегий рыб.

Сравнительный анализ микробного разнообразия на уровне крупных таксонов: домены Bacteria (EUB) и Archaea (ARC); филы Actinobacteria (ACT), Bacteroidetes (CF), Planctomycetes (PLA), Firmicutes (BLS), Cyanobacteria (CYA) и Spirochaetes (SPI), а также классы филы Proteobacteria: Alpha (ALF), Beta (BET) и Gamma (GAM) с помощью групп-специфичной амплификации не выявил отличий в структуре микробных сообществ кишечной микробиоты омуля трех МЭГ в весенний период. Типичная электрофореграмма приведена на рисунке А. В осенний период у омуля пелагической МЭГ сохраняется такой же широкий спектр таксонов, в то время как у омуля придонно-глубоководной МЭГ разнообразие ниже; не были детектированы представители фил Spirochaetes и Bacteroidetes (рисунок, Б). Таксономический состав микробиоты омуля прибрежной МЭГ осенью сохраняется с перераспределением доминант: значительно уменьшается представленность всех классов протеобактерий, при этом увеличивается количество Spirochaetes (рисунок, В).

Спектр таксономических групп кишечной микробиоты черного байкальского хариуса совпадает с таковым у прибрежного омуля в осенний период, дополнительно у хариуса детектируется байкальский генотип Mycoplasma (рисунок, Г).

Присутствие спирохет и микоплазм в кишечнике рыб может зависеть от типа питания рыб в целом. Микоплазмы и спирохеты отмечены у моллюсков [13]. В пищевом спектре черного байкальского хариуса моллюски являются одним из постоянных компонентов пищи [5]. В питании байкальского омуля моллюски встречаются реже, в основном у рыб, принадлежащих к прибрежной МЭГ.

Электрофореграмма ампликонов с суммарной ДНК, выделенной из кишечника байкальского омуля в весенний (А) и осенний (Б, В) периоды, и черного байкальского хариуса (Г) на групп-специфичных праймерах: EUB – домен Bacteria (900 п.н.); ARC – домен Archaea (600 п.н.); ALF – класс Alphaproteobacteria (400 п.н.); BET – класс Betaproteobacteria (350 п.н.); GAM – класс Gammaproteobacteria (150 п.н.); ACT – фила Actinobacteria (640 п.н.); CF – фила Bacteroidetes (1050 п.н.); CYA – фила Cyanobacteria (650 п.н.); PLA – фила Planctomycetes (420 п.н.); BLS – фила Firmicutes (400 п.н.); SPI – фила Spirochaetes (350 п.н.); Мус – байкальский генотип Mycoplasma (150 п.н.); M – маркер молекулярного веса

Микроорганизмы в ассоциациях, в том числе в составе кишечной микробиоты, формируют устойчивые сообщества, способные существовать неопределенно долго за счет поступающей извне энергии и биогенных элементов. Переход макроорганизма на другой тип питания сопровождается появлением новых пищевых компонентов и, как следствие, изменением разнообразия микроорганизмов, это подтверждается результатами анализа микробиоты КТ осенних популяций омуля прибрежной и придонно-глубоководной МЭГ. Пищевые спектры рыб достаточно широки, но качественный состав кормовых объектов, составляющих основу их питания, различен. Различия в составе микробных ассоциаций также отмечены и на уровне таксонов более низкого уровня – родовой принадлежности отдельных представителей как аллохтонной, так и автохтонной микробиоты (таблица). Для черного байкальского хариуса среди представителей классов Gamma и Betaproteobacteria определены последовательности, имеющие высокую гомологию с таковыми из кишечной микробиоты байкальского омуля.

Сравнительный анализ кишечных микробиоценозов черного байкальского хариуса и байкальского омуля

Наличие представителей родов Comamonas, Stenotrophomonas и Pseudomonas (Pseudomonas sp., P. putida, P. stutzeri, P. reactans и P. rhodesiae) может быть связано с их присутствием в байкальской воде или в ассоциациях с общими для черного байкальского хариуса и байкальского омуля кормовыми объектами. Также к аллохтонной микробиоте следует отнести некоторых представителей класса Alphaproteobacteria, детектированных в кишечнике черного байкальского хариуса: их ближайшие родственники выделены из ассоциаций с растениями (Bradyrhizobium sp.) и из пресных вод (Azospirillum sp.).

В то же время в составе кишечного микробиоценоза у черного байкальского хариуса определены ближайшие родственники Caulobacter sp. и Sphingomonas sp. (класс Alphaproteobacteria), которые имеют высокую гомологию с некультивируемыми бактериями, выделенными из кишечной микробиоты различных организмов. Так, среди их ближайших гомологов следует отметить некультивируемые бактерии, идентифицированные в кишечнике амура (FR853581), Tamarixia radiata (EF433789) и Sphenophorus levis (FJ626264), симбионтов Nilaparvata lugens (FJ774970), китайского краба Eriocheir sinensis (DQ856499), анчоуса (DQ860013) и антарктических рыб [12]. Несомненно, данные микроорганизмы можно отнести к автохтонной микробиоте байкальских рыб. Представитель рода Delftia (HM587796) (класс Betaproteobacteria, сем. Comamonadaceae) идентифицирован в кишечнике термитов, другие представители этого рода, D. tsuruhatensis и D. lacustris, способны разрушать пептидогликан и проявляют хитиназную активность [8]. К собственной кишечной микробиоте черного байкальского хариуса следует отнести представителей родов Enterobacter и Salmonella, последовательности которых идентичны таковым из кишечника байкальского омуля, а также Escherichia (класс Gammaproteobacteria, сем. Enterobacteriaceae), имеющие высокую гомологию (99 %) с микроорганизмами, культивированными из кишечника насекомых (HQ407235, HQ154567) и полученными в результате молекулярно-генетического анализа слизистой кишечника радуж ной форели [9].

Заключение

Таким образом, исследование структуры микробных сообществ кишечника байкальского омуля трех МЭГ и черного байкальского хариуса с помощью групп-специфичной ПЦР позволило определить спектр таксонов микроорганизмов, населяющих кишечник рыб, и его сезонные изменения. При смене спектра питания увеличивается разнообразие доминирующих микроорганизмов (омуль прибрежной МЭГ), а стабильность питания ведет к формированию устойчивого микробного сообщества с уменьшением числа таксономических единиц (омуль придонно-глубоководной МЭГ). Выявлены представители аллохтонной и автохтонной микробиоты, общие и отличающиеся для разных видов рыб.

Работа выполнена в рамках проекта VI.50.1.4 «Молекулярная экология и эволюция живых систем Центральной Азии на примере рыб, губок и ассоциированной с ними микрофлоры», № гос. рег. 01201353444.

Анганова Е.В., д.б.н., старший научный сотрудник лаборатории эпидемически и социально значимых инфекций, ФГБНУ НЦ «Проблем здоровья семьи и репродукции человека» ФАНО, г. Иркутск;

Савилов Е.Д., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник ФГБНУ НЦ «Проблем здоровья семьи и репродукции человека» ФАНО, г. Иркутск.

Работа поступила в редакцию 26.11.2014.

Библиографическая ссылка