Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Кореньков Д.А. 1 Исакова-Сивак И.Н. 1 Кузнецова В.А. 1 Лосев И.В. 1 Руденко Л.Г. 1 Найхин А.Н. 1

---

1 ФГБУ «НИИ Экспериментальной медицины» СЗО РАМН

Вакцинные штаммы для живой гриппозной вакцины (ЖГВ) готовятся методом генетической реассортации актуальных циркулирующих вирусов с безвредным для человека донором аттенуации. В состав вакцинного штамма переходят поверхностные антигены от эпидемического вируса, а гены, кодирующие внутренние и неструктурные белки вириона, – от донора аттенуации. Иммунизация ЖГВ вызывает формирование не только гуморального, но и клеточного иммунного ответа, наиболее важным звеном которого является индукция вирусспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) к внутреннему белку вириона – нуклеопротеину (NP). Ввиду того, что донор аттенуации для ЖГВ типа А – штамм А/Ленинград/134/17/57 (Лен/17) – происходит от вируса, выделенного в 1957 году, представлялось необходимым оценить, будут ли ЦТЛ, специфичные к NP белку вируса Лен/17, распознавать нуклеопротеины современных вирусов гриппа А. Мы провели иммуноэпитопный анализ in silico NP белков 757 штаммов вируса гриппа А подтипов H1N1 и H3N2, выделенных в 2009–2014 гг., в сравнении с донором аттенуации Лен/17, и показали, что большая часть предсказанных иммунодоминантных ЦТЛ-эпитопов NP белка вируса Лен/17 отсутствует у подавляющего большинства циркулирующих вирусов гриппа. Полученные данные указывают на необходимость включения в вакцинные штаммы ЖГВ NP гена от актуальных вирусов гриппа либо проведения точечного мутагенеза NP белка вируса Лен/17 с целью включения основных иммунодоминантных ЦТЛ-эпитопов современных вирусов.

Статья в формате PDF

433 KB

вирус гриппа

иммунодоминантный эпитоп

цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ)

нуклеопротеин

живая гриппозная вакцина

1. Aleksandrova G.I. [Use of the genetic recombination method for obtaining vaccinal strains of the influenza virus] // Vopr Virusol. – 1977. № 4. – C. 387–95.

2. Bao Y., Bolotov P., Dernovoy D., Kiryutin B., Zaslavsky L., Tatusova T., Ostell J., Lipman D. The influenza virus resource at the National Center for Biotechnology Information // J Virol. – 2008. – T. 82, № 2. – C. 596–601.

3. Berkhoff E. G.M., Geelhoed-Mieras M.M., Fouchier R.A.M., Osterhaus A.D. M. E., Rimmelzwaan G.F. Assessment of the extent of variation in influenza A virus cytotoxic T-lymphocyte epitopes by using virus-specific CD8+ T-cell clones // Journal of General Virology. – 2007. – T. 88, № 2. – C. 530–535.

4. Bui H.H., Sidney J., Li W., Fusseder N., Sette A. Development of an epitope conservancy analysis tool to facilitate the design of epitope-based diagnostics and vaccines // BMC Bioinformatics. – 2007. – T. 8. – C. 361.

5. Calis J.J., Maybeno M., Greenbaum J.A., Weiskopf D., De Silva A.D., Sette A., Kesmir C., Peters B. Properties of MHC class I presented peptides that enhance immunogenicity // PLoS Comput Biol. – 2013. – T. 9, № 10. – C. e1003266.

6. Delport W., Poon A. F.Y., Frost S.D.W., Kosakovsky Pond S.L. Datamonkey 2010: a suite of phylogenetic analysis tools for evolutionary biology // Bioinformatics. – 2010. – T. 26, № 19. – C. 2455-–2457.

7. Grant E., Wu C., Chan K.F., Eckle S., Bharadwaj M., Zou Q.M., Kedzierska K., Chen W. Nucleoprotein of influenza A virus is a major target of immunodominant CD8+ T-cell responses // Immunol Cell Biol. – 2013. – T. 91, № 2. – C. 184–94.

8. Isakova-Sivak I., Chen L.M., Matsuoka Y., Voeten J.T., Kiseleva I., Heldens J.G., den Bosch H., Klimov A., Rudenko L., Cox N.J., Donis R.O. Genetic bases of the temperature-sensitive phenotype of a master donor virus used in live attenuated influenza vaccines: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) // Virology. – 2011. – T. 412, № 2. – C. 297–305.

9. Kreijtz J.H., de Mutsert G., van Baalen C.A., Fouchier R.A., Osterhaus A. D., Rimmelzwaan G. F. Cross-recognition of avian H5N1 influenza virus by human cytotoxic T-lymphocyte populations directed to human influenza A virus // J Virol. – 2008. – T. 82, № 11. – C. 5161–6.

10. Larsen M.V., Lundegaard C., Lamberth K., Buus S., Lund O., Nielsen M. Large-scale validation of methods for cytotoxic T-lymphocyte epitope prediction // BMC Bioinformatics. – 2007. – T. 8. – C. 424.

11. Naikhin A.N., Donina S.A., Petukhova G.D., Koren kov E.M., Doroshenko E.M., Grigor’eva E.P., Suvorova M.A., Rudenko L.G. [Humoral and cell-mediated immune responses in humans to the A/California/07/ 2009 (H1N1) virus, A(H1N1)pdm2009] // Vopr Virusol. – 2013. – T. 58, № 2. – C. 38–42.

12. Nielsen M., Lundegaard C., Lund O., Kesmir C. The role of the proteasome in generating cytotoxic T-cell epitopes: insights obtained from improved predictions of proteasomal cleavage // Immunogenetics. – 2005. – T. 57, № 1–2. – C. 33–41.

13. Fast, scalable generation of high‐quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega / Sievers F., Wilm A., Dineen D., Gibson T.J., Karplus K., Li W., Lopez R., McWilliam H., Remmert M., Söding J., Thompson J.D., Higgins D.G., 2011. – T. 1.

14. Vita R., Overton J.A., Greenbaum J.A., Ponomarenko J., Clark J.D., Cantrell J.R., Wheeler D.K., Gabbard J.L., Hix D., Sette A., Peters B. The immune epitope database (IEDB) 3.0 // Nucleic Acids Res. – 2014.10.1093/nar/gku938.

Вирусы гриппа типа А являются высококонтагиозными респираторными патогенами, представляющими постоянную угрозу мировому сообществу. Ежегодные эпидемии гриппа вызывают от 3 до 5 миллионов случаев тяжелых респираторных заболеваний, не менее 250 тысяч из которых заканчиваются летальным исходом. Наиболее эффективным средством борьбы с гриппом является вакцинация. В настоящее время в практике здравоохранения применяется два вида гриппозных вакцин – инактивированные (ИГВ) и живые холодоадаптированные реассортантные (ЖГВ).

Иммунизация при помощи ИГВ приводит к формированию мощного гуморального иммунного ответа к поверхностным антигенам вируса гриппа – гемагглютинину (HA) и нейраминидазе (NA). Однако такой иммунный ответ является узкоспецифичным, т.е. неспособным защитить привитого от дрейфовых вариантов вируса гриппа. В отличие от ИГВ, иммунизация ЖГВ приводит к формированию широкого спектра иммунитета, включая индукцию местного (локального) иммунного ответа, а также стимуляцию CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) [11]. Иммунитет, опосредованный ЦТЛ, является перекрестным к различным сероподтипам вируса гриппа А, поскольку эти клетки распознают консервативные участки вирусных белков. Таким образом обеспечивается перекрестная защита привитых от дрейфовых и даже пандемических вариантов вирусов гриппа А [9]. Основной мишенью для образования CD8+ Т-клеток является молекула нуклеопротеина вируса гриппа А, содержащая наибольшее число эпитопов для ЦТЛ [7].

Вакцинные штаммы для ЖГВ готовятся путем реассортации генов дикого циркулирующего вируса гриппа А и холодоадаптированного донора аттенуации
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). В результате вакцинный штамм приобретает гены поверхностных белков (HA и NA) от дикого вируса, а вся часть генов внутренних белков, в том числе нуклеопротеина (NP) – от донора аттенуации [1]. Последние определяют безвредность (аттенуацию) ЖГВ. Однако донор аттенуации был получен из штамма 1957 года выделения и за более чем 50 лет нуклеопротеин циркулирующих вирусов мог значительно эволюционировать. Это несоответствие могло отразиться на антигенных свойствах современных вирусов и, как следствие, снижать спектр эффективности цитотоксического иммунитета у людей при вакцинации вирусом с антигенно устаревшим геном NP.

Цитотоксические T-клетки распознают пептиды, представленные молекулами МНС с помощью Т-клеточного рецептора. Презентация вирусных пептидов в составе молекул МНС класса I обеспечивает элиминацию инфицированных клеток цитотоксическими CD8+ Т-клетками. Эффективность презентации вирусного пептида (способности быть эпитопом) складывается из двух составляющих: процессинга пептидов в пути презентации с МНС молекулами I класса и иммуногенности комплекса пептид-МНС. Основанные на анализе процессинга и презентации пептидов математические модели предсказания иммунодоминантных эпитопов недавно стали доступны в базе данных The immune epitope database 3.0 (IEDB) [14].

Целью настоящего исследования явился сравнительный анализ in silico молекулярной эволюции ЦТЛ-иммуноэпитопов нуклепротеина современных циркулирующих вирусов гриппа А (H1N1 и H3N2) в сравнении с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) – Лен/17.

Материалы и методы исследования

Алгоритм настоящего исследования приведен на рисунке. Анализ данных проводился в несколько этапов, описание которых приведено ниже.

Алгоритм проведения in silico анализа консервации (консервативности) иммунногенных Т-клеточных МНС-I эпитопов нуклеопротеина в актуальных циркулирующих штаммах вируса гриппа А. NCBI IVSD – NCBI Influenza Virus Sequence Database, IEDB – The immune epitope database

Отбор последовательностей нуклеопротеина актуальных штаммов вируса гриппа А проводили с помощью базы данных NCBI Influenza Virus Sequence Database [2]. Отбирали уникальные полные белковые последовательности нуклеопротеина вируса гриппа А подтипов H1N1 и H3N2, выделенных повсеместно от человека с 2009 года по настоящее время (октябрь 2014). Из поиска были исключены лабораторные штаммы. После выравнивания алгоритмом CrustalO [13] и проверки на отсутствие полной гомологии было получено 757 уникальных последовательностей (табл. 1). Последовательность нуклеопротеина Лен/17 была получена из локальной базы данных отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева, ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН [8]

Таблица 1

Объем выборки изолятов вируса гриппа А в проводимом исследовании

Поиск Т-клеточных эпитопов проводили в базе данных иммунноэпитопов IEDB с помощью алгоритма предсказания ЦТЛ-эпитопов netCTL [10]. Параметры вклада С-концевого протеолиза, эффективности транспорта TAP (Transporter associated with antigen processing), порога отбора эпитопов были 0,15; 0,05 и 0,75, соответственно. Картирование эпитопов на последовательности вакцинного штамма вируса гриппа А Лен/17 производилось с помощью алгоритма выравнивания CrustalO в программе Jalview 2.8.1.

Предсказание Т-клеточной иммуногенности эпитопов проводили в базе данных иммуноэпитопов IEDB с помощью алгоритма T cell class I pMHC immunogenicity predictor [5]. Маскирование пептидов было проведено по 1, 2 и С-концевой аминокислотам. Эпитопы с баллом иммуногенности больше 0 (средний балл для неиммуногенных пептидов [5]) были отобраны для дальнейшего анализа

Поиск сайтов протеолиза нуклеопротеина проводили в базе данных иммунноэпитопов IEDB с помощью алгоритма протеосомного процессинга пептидов netChop [12]. Использовали метод анализа С-концевого протеолиза 3.0 с порогом 0,5.

Анализ консервации эпитопов проводили в базе данных иммуноэпитопов The immune epitope database (IEDB) 3.0 с помощью алгоритма epitope Conservancy Analysis [4] в режиме оценки линейных эпитопов с порогом идентичности последовательности не менее 100 %. Идентичные последовательности удалялись перед анализом. Консервация эпитопа выражалась в виде процента штаммов с полностью гомологичными ему последовательностями относительно всей исследуемой выборки вирусов гриппа А.

Результаты исследования
и их обсуждение

При поиске Т-клеточных эпитопов в последовательности нуклеопротеина вируса гриппа Лен/17 было выявлено 210 9-мерных эпитопов для двенадцати HLA супертипов класса I (А1, А2, А3, А24, А26, B8, B27, B39, B44, B58, B62). Около половины эпитопов (103/210) были уникальными и связывались с молекулами HLA не более одного супертипа. После объединения общих эпитопов для нескольких HLA-супертипов были получены 138 уникальных последовательностей. Далее список из 138 эпитопов был ограничен теми, которые проходили проверку теста предсказания иммуногенности Т-клеточных эпитопов. Доля иммуногенных эпитопов составила 49 % (68/138). Для исключения эпитопов с высоким риском протеолиза при протеосомном процессинге нуклеопротеина, из 68 были отобраны эпитопы не более чем с 1 предсказанным сайтом протеолиза. Доля эпитопов нуклепротеина Лен/17, прошедших эту проверку, составила 26 % (18/68). Таким образом, с помощью применённого алгоритма (рисунок) были отобраны 18 из 210 проанализированных эпитопов, которые отвечали критериям ЦТЛ-иммуногенности и малой вероятностью протеолиза.

В табл. 2 представлены результаты анализа консервации иммуногенных эпитопов Лен/17. Анализ консервации позволяет оценить долю вирусов из исследуемой выборки, несущих в нуклеопротеине полностью гомологичные Лен/17 эпитопы (далее процент консервации). Из данных табл. 2 видно, что лишь 8 из 18 отобранных эпитопов (44,4 %) были высококонсервативны, т.е. сохранялись в большинстве исследуемых нуклепротеинов вируса гриппа А (90 % и более штаммов с идентичными последовательностями). Тогда как остальные 10 иммуногенных эпитопов были идентичны лишь у 4–33 % современных циркулирующих вирусов гриппа А. Такая вариация в степени консервативности этих эпитопов говорит о различных механизмах селектирующего действия на вирусы. Опираясь на полученные данные, можно говорить о двух типах отбора иммуногенных ЦТЛ-эпитопов. В первую группу эпитопов входят высококонсерватиные последовательности (с процентом консервации более 90 %), во-вторую – низкоконсервативные последовательности (с консервацией 4–33 %). Оценка влияния отбора на эпитопы требует проверки и может быть установлена с помощью алгоритмов оценки молекулярной эволюции [6].

Таблица 2

Консервативность ЦТЛ-эпитопов нуклеопротеина (NP) донора
аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) по отношению к современным штаммам вирусов гриппа А (H1N1 и H3N2)

Более того, в штаммах с отсутствием полностью гомологичных исследуемым эпитопам последовательностей совпадало от 5 до 8 аминокислотных остатков в 9-мерных пептидах. Замена даже одной аминокислоты может кардинально изменять иммуногенность пептида [3].

Важно отметить, что из семи наиболее иммуногенных эпитопов нуклеопротеина вируса Лен/17 (с уровнем предсказанной иммуногенности выше 0,2) лишь два эпитопа (NP250-258 и NP200-208) встречались у большинства циркулирующих штаммов вируса гриппа А (92–98 %). Остальные 5 иммуногенных эпитопов нуклеопротеина Лен/17 (114–122, 439–447, 438–446, 213–221 и 30–38) встречались только у 4–33 % современных вирусов.

Эти данные свидетельствуют о том, что ЦТЛ иммунный ответ, индуцированный вакцинацией штаммами ЖГВ, содержащими ген NP от вируса Лен/17, может быть направлен на 8 из 18 эпитопов (или на 2 из 7 высокоиммуногенных эпитопов) против инфекции актуальными вирусами гриппа А, что может сказаться на выраженности и спектре действия вирус-специфичного ЦТЛ иммунитета.

Устранить указанный недостаток современных штаммов ЖГВ можно двумя способами: первое – переносить в геном вакцинных штаммов ЖГВ, помимо поверхностных антигенов современных циркулирующих вирусов гриппа А, также и их NP ген. Второе – выявить аминокислотные остатки в NP белке донора аттенуации Лен/17, отличающиеся от циркулирующих штаммов вируса гриппа А и находящиеся в иммунодоминантных ЦТЛ-эпитопах последних. Точечный мутагенез таких аминокислот с помощью методов обратной генетики позволит создавать вакцинные штаммы ЖГВ с актуальным набором иммунодоминантных эпитопов в их нуклеопротеине.

Заключение

С помощью математических моделей было предсказано наличие иммуногенных Т-клеточных эпитопов в нуклеопротеине донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), презентируемых в составе молекул МНС класса I. При анализе консервации показано, что больше половины этих эпитопов отсутствует у подавляющего числа современных вирусов гриппа А подтипов H1N1 и H3N2, циркулирующих с 2009 года. Эти данные свидетельствуют о возможном недостаточно широком спектре цитотоксических вирус-специфичных Т-клеток индуцированных ЖГВ для защиты от актуальных
вирусов гриппа А. Обнаруженные эпитопы могут быть использованы в качестве перспективных мишеней для создания обратно-генетических вакцининдуцирующих широкий перекрестный цитотоксический Т-клеточный иммунитет против актуальных штаммов на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского Научного Фонда № 14-15-00034.

Назаров П.Г., д.м.н., профессор, зав. отделом иммунологии, ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург;

Кривицкая В.З., д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии диагностических препаратов отдела биотехнологии, ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ, г. Санкт-Петербург.

Работа поступила в редакцию 06.11.2014.

Библиографическая ссылка