Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Морозов А.В. 1

---

1 Пятигорский медико-фармацевтический институт

Разработан биосинтетический способ получения адеметионина. Суть метода заключается в накоплении адеметионина в клетках дрожжей в метионин-содержащей среде. Дрожжи промывают дважды избытком холодной воды, а затем лизируют в течение 2 часов путем добавления этилацетата в качестве селективного экстрагента, а также 0,15 М кислоты серной. После лизиса раствор, содержащий адеметионин, отделяют от остатков дрожжей с помощью центрифугирования. Очистку полученного лизата проводят путем добавления к лизату 10 % водного раствора кислоты пикролоновой. Образующийся пикролонат адеметионина отстаивают в течение 12 часов, после чего промывают дважды избытком холодной воды и высушивают. На заключительной стадии пикролонат адеметионина разрушают с помощью добавления кислоты серной, п-толуолсульфокислоты и органического растворителя, не смешивающегося с водой, – н-бутанол. Полученную смесь отстаивают в течение 20 минут, далее удаляют органическую фазу, а к водной добавляют небольшое количество н-бутанола для удаления остатков кислоты пикролоновой. В результате получают водный раствор адеметионина, который осаждают этанолом, а полученное твердое вещество растворяют в 15 % метанольном растворе п-толуолсульфокислоты. На заключительной стадии к полученному раствору добавляют хлороформ для осаждения двойной соли адеметионина. Соль высушивают и добавляют к ней лактозу в соотношении 1:1.

Статья в формате PDF

342 KB

адеметионин

двойная соль

биосинтез

1. Регистр лекарственных средств России РЛС Энциклопедия лекарств. – 19-й вып. / под ред. Г.Л. Вышковского. – М.: РЛС-МЕДИА, 2010. – С. 80.

2. Aminosugar, glycosaminoglycan, and S-adenosylmethionine composition for the treatment and repair of connective tissue [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.google.ru/patents/US6271213.

3. Composition and use of ademetionine against ageing of the skin [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.google.com/patents/US4956173.

4. Stable salts of S-adenosyl-L-methionine with polyanions [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.google.co.in/patents/US4764603.

5. Sulphonic acid salts of S-adenosilmethionine [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.google.com/patents/US4057686.

Адеметионин (S-аденозил-L-метионин) играет важную роль в биохимических процессах в организме человека. Он участвует в реакциях трансметилирования, является предшественником цистеина, таурина, глутатиона. Применяется адеметионин при внутрипеченочном холестазе, токсическом поражении печени, в том числе алкогольном, лекарственном, при вирусном гепатите и т.п. Адеметионин вырабатывается клетками печени. Однако при некоторых заболеваниях печени требуется принимать дополнительно адеметионин в качестве лекарственного средства [1].

В настоящее время субстанция адеметионина в РФ не производится.

Нами поставлена цель изучить существующие способы и разработать наиболее доступный способ получения адеметионина.

Описанные в литературе способы получения адеметионина можно разделить на три группы.

Один из первых способов получения адеметионина, который разработал Д. Кантони, заключался в синтезе адеметионина из аденозинтрифосфата (АТФ) и метионина в присутствии очищенного печеночного фермента метионинаденозилтрансферазы. В настоящее время метод не применяется из-за сложности выделения и очистки фермента [2].

Аналогичный метод получения адеметионина из АТФ и метионина отличается лишь тем, что метионинаденозилтрансферазу получают из дрожжевого экстракта. Этот метод также требует выделения и очистки фермента.

Ко второй группе методов можно отнести синтез адеметионина путем метилирования S-аденозил-L-гомоцистеина. Варианты такого синтеза различаются метилирующими агентами. Однако эти методы оказались непригодными, так как в результате синтеза образуется неактивный S,Rизомер и лишь небольшая часть активного S,S-изомера. Помимо этого указанный метод дает большое количество примесей из-за возможностей метилирования разных реакционных центров S-аденозил-L-гомоцистеина [3].

С практической точки зрения наиболее успешными оказались методы биосинтеза адеметионина. Сущность метода заключается в накоплении адеметионина в дрожжевых клетках в питательной среде, обогащенной метионином, лизисе дрожжевых клеток и выделении адеметионина [4, 5].

Нами изучена возможность получения адеметионина методом биосинтеза.

В качестве продуцента адеметионина мы использовали Saccharomyces сerevisiae, а в качестве питательной среды была выбрана среда Шленка.

Дрожжи культивировали в течение 24–30 часов при постоянном перемешивании и аэрации при температуре 30 °С. Затем проводили лизис дрожжей, содержащих адеметионин, с помощью органического растворителя и разбавленной кислоты серной. В качестве органического растворителя нами был использован этилацетат, а оптимальной концентрацией серной кислоты оказалась концентрация от 0,05 до 0,2 моль/л. Время проведения лизиса – 2 часа при постоянном перемешивании. Экстракция данным способом позволяет получить практически 100 % адеметионина, присутствующего в дрожжах. Полученный лизат отделяли от остатков дрожжей при помощи центрифугирования.

На следующей стадии осуществляли очистку лизата. Для этого адеметионин из лизата осаждали 10 % раствором пикролоновой кислоты в н-бутаноле, который добавляли при перемешивании к предварительно подкисленному до pH 2 лизату. Полученный осадок отстаивали в течение 12 часов, отфильтровывали и промывали дважды холодной водой.

На заключительной стадии получали стабильную соль адеметионина с толуолсульфокислотой.

К высушенному осадку пикролоната адеметионина добавляли при энергичном встряхивании растворы 0,1 моль/л серной и толуолсульфокислоты, органический растворитель – н-бутанол. Отстаивали в течение 20 минут, органический слой удаляли, водный слой промывали н-бутанолом до удаления следов пикролоновой кислоты. Затем к водному слою добавляли обесцвечивающий уголь, затем фильтровали.

К полученному бесцветному водному раствору добавляли этанол. Образующийся осадок отделяли декантацией и растворяли в метанольном растворе толуолсульфокислоты с концентрацией 15 %.

На заключительной стадии к полученному раствору добавляли хлороформ, который осаждает двойную соль адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой.

Полученная таким образом соль адеметионина представляет собой гигроскопичный порошок, очень легко растворимый в воде, практически нерастворимый в этаноле, ацетоне и других органических растворителях.

Для уменьшения гигроскопичности к полученной субстанции добавляли лактозу в соотношении 1:1.

Методом УФ-спектроскопии была подтверждена подлинность полученной соли а также установлен количественный состав компонентов.

УФ-спектроскопию использовали для идентификации полученной соли. Водный раствор соли в области от 200 до 300 нм должен иметь 2 максимума, соответствующих адеметионину 258 ± 2 нм и п-толуолсульфокислоте 230 ± 2 нм.

Для этого точную навеску полученной соли (около 0,2 г) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл воды, растворяли и доводили тем же растворителем содержимое колбы до метки. Аликвоту в количестве 1 мл переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили водой до метки и регистрировали спектр поглощения в области от 220 до 300 нм (рис. 1).

Как видно из рис. 1, в спектре поглощения раствора испытуемого образца имеются 2 максимума при длинах волн 231 нм (п-толуолсульфокислота) и 256 нм (адеметионин).

Для количественного определения компонентов нами разработана спектрофотометрическая методика.

На первом этапе исследований нами была приготовлена модельная смесь адеметионина с п-толуолсульфокислотой с целью определения возможности использования непосредственного спектрофотометрического метода.

На рис. 2 представлен спектр поглощения модельной смеси, содержащей адеметионин и п-толуолсульфокислоту.

Из приведенного спектра видно, что полосы поглощения веществ перекрываются и делают невозможным непосредственное спектрофотометрическое определение адеметионина и п-толуолсульфокислоты. Поэтому для определения их содержания нами был использован метод Фирордта. На основании полученного спектра поглощения были выбраны аналитические длины волн. Готовили 6 модельных смесей адеметионина и п-толуолсульфокислоты, для которых аналитические длины волн были равны λ1 = 231 нм и λ2 = 256 нм.

Рис. 1. Спектр поглощения раствора соли адеметионина с п-толуолсульфокислотой

Рис. 2. Спектр поглощения модельной смеси, содержащей адеметионин и п-толуолсульфокислоту

Точную навеску модельной смеси (около 0,1 г) растворяли в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50 мл воды, доводили раствор в колбе до метки тем же растворителем. Аликвоту в количестве 5 мл переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки водой. Оптическую плотность раствора измеряли при длинах волн 231 и 256 нм. Раствор сравнения – вода.

Для расчёта каждого компонента в смеси определяли удельный показатель поглощения при длинах волн 231 и 256 нм.

Таблица 1

Значение удельных показателей поглощения при аналитических длинах волн

Расчет содержания каждого компонента в образцах проводили путем решения системы уравнений

А1 = Х1Е11 + Х2Е12

А2 = Х1Е21 + Х2Е22

Таким же образом было проведено определение компонентов в соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой.

Таблица 2

Результаты определения адеметионина и п-толуолсульфокислоты в модельной смеси

Результаты определения приведены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты анализа двойной соли

Приведенные результаты показывают, что методика определения соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой позволяет определить все компоненты с погрешностью не более 3 %.

Выводы

1. Разработан биосинтетический способ получения двойной соли адеметионина.

2. Разработаны спектрофотометрические методики подлинности двойной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой.

3. Разработаны методики количественного определения компонентов двойной соли при помощи метода Фирордта.

Рецензенты:

Лазарян Д.С., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой фармацевтической химии Пятигорского медико-фармацевтического института, филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ, г. Пятигорск;

Кодониди И.П., д.фарм.н., доцент кафедры органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института, филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ, г. Пятигорск.

Работа поступила в редакцию 25.12.2013.

Библиографическая ссылка