Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Лобанова И.Ю. 1 Турецкова В.Ф. 1 Зверев Я.Ф. 1 Талалаева О.С. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России

Проведено исследование острой токсичности и антиоксидантной активности экстракта листьев осины сухого. При энтеральном введении крысам и мышам в дозах от 2500 мг/кг до 10000 мг/кг острой токсичности не выявлено, гибель животных отсутствовала, что не позволило установить летальную дозу экстракта (LD50). В связи с чем, изучаемый препарат может быть отнесен согласно ГОСТ 12.1.007-76 к IV классу опасности (малоопасные вещества). В экспериментах in vitro установлены высокая антиоксидантная (67,01,12%) и низкая прооксидантная (25,11,68%) активности исследуемого экстракта. Полученные данные свидетельствует о том, что биологически активные вещества экстракта способны подавлять процессы пероксидации, выступая в роли прямого антиоксиданта, и не обладают способностью прямо индуцировать перекисное окисление липидов клеточных мембран.

Статья в формате PDF

302 KB

осина обыкновенная

экстракт сухой

острая токсичность

антиоксидантная активность

прооксидантная активность

1. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: Медгиз, 1963. - 152 с.

2. Головкин Б.Н. Биологически активные вещества растительного происхождения. - М.: Наука, 2001.

3. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности: ГОСТ 12.1.007-76. - 2 с.

4. Ильина Е.И., Турецкова В.Ф., Лобанова И.Ю. Изучение состава фенольных соединений экстракта листьев осины обыкновенной сухого // Актуальные проблемы фармакологии и фармации: сб. науч. статей. - Вып. VII. - Барнаул, 2010. - С. 74-81.

5. Кьосев П.А. Полный справочник лекарственных растений. - М.: ЭКСМО, 2002. - 992 с.

6. Лобанова И.Ю. Выбор оптимальных параметров факторов, влияющих на процесс извлечения биологически активных веществ из листьев осины обыкновенной // Молодежь - Барнаул: материалы XI городской научно-практической конференции молодых ученых (17-20 ноября 2009 г.): в 2 т. / отв.ред. Б.А. Черниченко. - Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2010. - Т. 2. - С. 119-120.

7. Лобанова И.Ю., Турецкова В.Ф. Изучение состава основных биологически активных веществ гидрофильной фракции листьев осины обыкновенной // 35 лет фармацевтическому факультету АГМУ: итоги и перспективы: материалы научно-практической конференции, посвященной 35-летию фармацевтического факультета. - Барнаул, 2010. - С. 82-88.

8. Минеева Т.Н., Арбузова Я.С., Зверев Я.Ф. Определение антиоксидантной и оксидантной активности in vitro водных и спиртовых извлечений из листьев зимолюбки зонтичной, ортилии однобокой, грушанки круглолистной // Актуальные проблемы фармации: сб. науч. статей. - Вып. II. - Барнаул, 2005. - С. 79-82.

9. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.

10. Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям. - М.: Металлургия, 1990. - 427 с.

11. Шкарина Е.И., Максимова Т.В., Никулина И.Н. О влиянии биологически активных веществ на антиоксидантную активность фитопрепаратов // Химико-фармацевтический журнал. - 2001. - №6. - С. 40-47.

В последние годы проводится активный поиск растительных источников получения препаратов противовоспалительного действия для использования в комплексной терапии различных заболеваний, которые по сравнению с синтетическими препаратами имеют ряд преимуществ, основным из которых является мягкое воздействие на организм при отсутствии выраженной токсичности. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что одним из механизмов противовоспалительного действия растительных лекарственных препаратов является подавление процессов свободно-радикального окисления в организме. При этом выявлено, что высокое содержание фенольных соединений обусловливает антиоксидантную активность извлечений из лекарственного растительного сырья, которые используются для коррекции антиоксидантного статуса организма [10, 11].

В указанном контексте наше внимание привлекли листья осины обыкновенной (Populus tremula L.), семейство ивовых (Salicaceae), род тополь (Populus), которые используются в народной медицине в качестве противовоспалительных, противоревматических, обезболивающих, противогеморроидальных средств, содержат разнообразный комплекс фенольных соединений [2, 5]. Несмотря на это, до настоящего времени отсутствуют официнальные лекарственные средства из данного вида сырья.

В связи с этим, на кафедре фармацевтической технологии Алтайского государственного медицинского университета была разработана рациональная технология экстракта листьев осины сухого, обеспечивающая высокое содержание в данном экстракционном препарате фенольных соединений (флавоноидов, фенологликозидов, фенолокислот, дубильных веществ) и проведена его стандартизация [4, 6].

Необходимыми этапами разработки нового лекарственного средства, обладающего противовоспалительным действием, является не только определение его специфической, но и выявление возможной антиоксидантной активности, а также изучение его безвредности.

Целью нашего исследования явилось определение острой токсичности экстракта листьев осины сухого и установление его предполагаемого влияния на процессы свободно-радикального окисления.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлся экстракт листьев осины сухой, полученный методом реперколяции в батарее из пяти диффузоров, с использованием в качестве экстрагента спирта этилового 40%, с последующей вакуумной сушкой при температуре не выше 40-50°С. Стандартизация препарата проводилась с использованием хроматографических (тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография), спектроскопических и спектрофотометрических методов. При этом выявлено высокое содержание разнообразных фенольных соединений, в том числе флавоноидов (гиперозид, рутин) - 6,89 ± 0,036% в пересчете на гиперозид, фенологликозидов (салицин, тремулацин) - 18,31 ± 0,854% в пересчете на салицин, фенолокислот (хлорогеновая, п-кумаровая, кофейная, феруловая кислоты) в пересчете на феруловую кислоту - 6,52 ± 0,324%, конденсированных дубильных веществ - 9,60 ± 0,251% [7].

Сырьем для получения сухого экстракта служили листья осины обыкновенной, заготовленные после окончания плодоношения в окрестностях г. Барнаула (конец июня 2009 г). Сырье сушили до воздушно-сухого состояния, упаковывали в двойные бумажные мешки и хранили в сухом прохладном месте.

Определение острой токсичности экстракта листьев осины сухого проводили согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [9] на сертифицированных половозрелых животных обоего пола - 40 белых крысах линии Wistar (массой 160-230 г) и 40 белых мышах (массой 20-25 г), полученных из вивария Института цитологии и генетики СО АН РФ и прошедших карантин в течение 14 суток. Содержание экспериментальных животных осуществлялось в стандартных условиях вивария на обычном рационе при свободном доступе к воде и пище, в условиях нормального температурного и светового режимов. Животные были разделены на 4 группы по 10 крыс (мышей) в каждой.

Первая группа животных получала перорально через желудочный зонд однократно или повторно через короткие интервалы времени (3-4 часа) в течение суток (в технически максимально возможных дозах) водный раствор экстракта листьев осины сухого в дозе 2500 мг/кг; вторая - в дозе 5000 мг/кг; третья - в дозе 7500 мг/кг; четвертая - в дозе 10000 мг/кг. Общая продолжительность наблюдения за животными после введения исследуемого препарата составила 14 дней. В первый день крысы (мыши) находились под непрерывным наблюдением.

Оценку общего состояния животных при введении экстракта проводили с учетом изменения поведенческих реакций, нервно-мышечной возбудимости, некоторых вегетативных функций, а также измеряли массу тела до введения изучаемого препарата и после окончания периода наблюдения [9].

Эксперименты проводили при строгом соблюдении требований Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей» (Страсбург, 1986 г.) и Федерального закона Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г.

Процесс свободно-радикального окисления оценивали in vitro. В качестве основного показателя, определяющего состояние антиоксидантной системы, использовалась общая антиоксидантная активность (ОАА). Антиоксидантную активность экстракта листьев осины сухого в виде 2%-ного водного раствора изучали с использованием модельной системы, которая базируется на способности различных объектов подавлять Fe²⁺/аскорбат-индуцированное окисление ТВИН-80 in vitro с последующим фотоколориметрическим определением продуктов окисления (малонового диальдегида) после предварительного добавления щелочного раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Оптическую плотность (А) измеряли на фотоэлектроколориметре при длине волны l = 535 нм [8].

Расчет антиоксидантного действия проводили по формуле

ОАА% = ((А_к - А_о)×100)/А_к,

где А_к - оптическая плотность в контроле; А_о- оптическая плотность в опыте.

В качестве параметра оксидантной системы оценивали общую проксидантную активность (ОПА). Суть биохимического метода определения прооксидантной активности в условиях in vitro заключается в способности исследуемых препаратов, в данном случае 2% водного раствора экстракта листьев осины сухого, окислять ТВИН-80, с последующим фотоколориметрическим определением концентрации продуктов окисления (малонового альдегида), ассоциированными тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Оптическую плотность (А) измеряли на фотоэлектроколориметре при длине волны l = 535 нм [8].

Расчет прооксидантного действия проводили по формуле

ОПА% = ((А_о - А_к)×100)/А_о,

где А_к - оптическая плотность в контроле; А_о - оптическая плотность в опыте.

Полученные в результате эксперимента данные обрабатывали статистически методом вариационных рядов с использованием t-критериев Стьюдента [1]. Результаты представлены в виде среднего значения X и ошибки среднего m. Достоверными считали различия при достигнутом уровне значимости p < 0,01.

При изучении острой токсичности энтеральное введение крысам и мышам экстракта листьев осины сухого в дозах от 2500 до 10000 мг/кг массы тела животного не влияло на их общее состояние и не привело к гибели животных. Симптомы острого отравления отсутствовали. В первые сутки у трех крыс-самок наблюдалось незначительное увеличение дефекации при введении экстракта в дозе 10000 мг/кг крысы. В последующем все животные были активны, подвижны, с нормальной координацией движений, стандартной реакцией на внешние раздражители, обычной частотой и глубиной дыхательных движений, нормальной консистенцией фекальных масс, частотой мочеиспускания и окраской мочи, с хорошим аппетитом и нормальным внешним видом. За период наблюдения мыши (самцы и самки) и крысы (самцы и самки) прибавили в массе (табл. 1).

Примечание: * - статистически значимые изменения между массой животных на 14-е сутки наблюдения и массой животных до введения препарата (p < 0,01).

В течение 14 суток эксперимента гибели животных не отмечено, в связи с чем, установить LD₅₀ не представилось возможным. Это позволяет считать исследуемый экстракт нетоксичным в испытанном диапазоне и варьировать его дозами в широких пределах (табл. 2).

Поскольку доза 10000 мг/кг не привела к смерти ни одного животного, можно сделать вывод, что LD₅₀ > 10000 мг/кг и согласно ГОСТ 12.1.007-76 можно отнести исследуемый экспериментальный препарат к IV классу опасности (малоопасные ве- щества) [3].

Результаты анализов по определению антиоксидантной и прооксидантной активности экстракта листьев осины сухого представлены в табл. 3.

Примечание: Z - показатель разницы между количеством погибших животных при использовании двух соседних доз; D - показатель разницы между количеством двух соседних доз.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в опытах in vitro для экстракта листьев осины сухого выявлена высокая активность в отношении процессов свободно-радикального окисления, что, по-видимому, связано с высоким содержанием разнообразных групп фенольных соединений, таких как флавоноиды, фенологликозиды, фенолокислоты, дубильные вещества, и их способностью влиять на изучаемый процесс. При этом исследуемый экстракт проявил как прооксидантную, так и антиоксидантную активность, причем последняя была выражена в значительно большей степени.

В связи с тем, что экстракт листьев осины сухой имеет высокие показатели общей антиоксидантной активности (67,0 ± 1,12%), не исключено, что он обладает способностью улавливать свободные радикалы и за счет этого подавлять процессы пероксидации, выступая в роли прямого антиоксиданта. Показатели общей прооксидантной активностьи изучаемого экстракта (25,1 ± 1,68%) свидетельствуют о том, что он в незначительной степени стимулирует прооксидантную активность и вряд ли обладает способностью прямо индуцировать перекисное окисление липидов клеточных мембран, которое имитирует ТВИН-80.

Примечание: ОАА - общая антиоксидантая активность, ОПА - общая прооксидантная активность.

При анализе результатов изучения острой токсичности при энтеральном введении животным (крысы, мыши) экстракта листьев осины сухого в дозах от 2500 до 10000 мг/кг признаков острой токсичности не выявлено, летальность отсутствовала, что не позволило установить LD₅₀. В связи с чем, изучаемый препарат может быть отнесен, согласно ГОСТ 12.1.007-76 к IV классу опасности (малоопасные вещества).

Суммируя данные экспериментов по изучению антиоксидантной и прооксидантной активности экстракта листьев осины сухого, можно заключить, что биологически активные вещества изучаемого экстракта способны подавлять процессы свободно-радикального окисления, моделируемые in vitro, о чем свидетельствуют высокие показатели общей антиоксидантной активности. Низкие показатели прооксидантной активности указывают на то, что данный экстракт не обладает способностью прямо индуцировать перекисное окисление липидов клеточных мембран.

Полученные данные подтверждают перспективность проведения дальнейших исследований по изучению противовоспалительной активности экстракта и получения на его основе безопасного эффективного противовоспалительного средства.

• Лампатов В.В., д-р биол. наук, профессор кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Барнаул;
• Зуева Е.П., д-р биол. наук, профессор, зав. лабораторией онкофармакологии ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г. Томск.

Работа поступила в редакцию 20.07.2012.

Библиографическая ссылка