Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,798

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Карпеченко К.А. 1, Землянухина О.А. 1, Моисеева Е.В. 2, Баранова Т.В. 2, Калаев В.Н. 2, Вепринцев В.Н. 1, Карпеченко Н.А. 1, Карпеченко И.Ю. 1, Кондратьева А.М. 1

---

1 ФГУП «Научно-исследовательский институт лесной генетики и селекции», Воронеж

2 ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», Воронеж

Подобраны условия для введения кизильника Даммера в стерильную пробирочную культуру in vitro: способ стерилизации, тип первичного экспланта, солевой и гормональный состав сред. Исследован ряд питательных сред для культивирования с целью определения наиболее оптимальных для поддержания и мультипликации in vitro. Были испробованы два варианта обеззараживания первичных эксплантов. Результаты показали, что только 7% растений, обработанных стерилизующим раствором, содержащим только «Белизну» в высокой концентрации, сохранились после двух недель культивирования. Во втором случае процент жизнеспособных эксплантов составил 69%. Таким образом, меньшая концентрация хлорсодержащего агента и мертиолят в обеззараживающем растворе способствуют лучшему избавлению от инфекции. Отработана методика избавления эксплантов кизильника Даммера от остаточной эндогенной инфекции путем отделения верхней части растущего побега от зараженного экспланта и помещения на свежую среду того же состава. Определены условия индукции корнеобразования в культуре in vitro. Подобраны факторы, необходимые для адаптации пробирочных растений в условиях закрытого грунта с целью их дальнейшего роста в открытом грунте. Полученные растения кизильника не имеют эндогенной инфекции, не витрифицированы, обладают хорошим ростом и развитием побегов и корневой системы.

Статья в формате PDF

671 KB

кизильник Даммера

введение in vitro

микроклональное размножение

культура тканей

эксплант

питательная среда

стерилизация

корнеобразование

1. Гревцова А.Т., Казанская Н.А. Кизильники в Украине. – Киев: Нива, 1997. – 192 с.

2. Деревья и кустарники. – М., Л-д.: изд-во акад. Наук СССР. – Т. III. – С. 872.

3. Курбанов М.Р. Качество семян кизильников, интродуцированных на Апшероне // Биология семян, интродуцированных растений. – М.: Наука, 1985. – С. 45–49.

4. Пояркова А.И. Cotoneaster Medic // Флора Узбекистана. – Ташкент: Изд-во АН УзССР, 1955. – Т.3. – С. 265–267.

5. Пояркова А.И. Новые виды кизильника для флоры Советского Союза и Китая // Ботанические материалы Гербария Ботанического института им. В.Л. Комарова АН СССР. – Л., 1961. – Т. 21. – С. 161–205.

6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. – Physiol. Plant. – 1962. – Vol. 15. – P. 473–497.

7. Sayed S. Sawsan and El-Karim, Seham G. (2007). Propagarion of Cotoneaster horizontalis Decne through in vitro culture. – Annals of Aric. Sc., Moshtohor, 2007. – Vol. 45, №2. – P. 761–772.

Кизильник Даммера (Cotoneaster Dammerii С.K. Schneid.) относится к семейству розоцветных (Rosaceae Juss.). Это вечнозеленое растение со стелющимися и часто укореняющимися ветвями. Листья эллиптические до эллиптически-продолговатых, сверху голые блестящие, снизу бледнее, серовато-зеленые. Цветки белые, обычно одиночные на короткой цветоножке. Плоды почти шаровидные, ярко-красные. Цветет в мае - июне, плодоносит в сентябре - октябре. Область распространения - Китай. Успешно используется на каменистых горках, откосах, подпорных стенках, где кизильник Даммера очень эффектен своими длинными стелющимися ветвями [1, 2, 3, 4, 5]. В условиях ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета кизильник Даммера является засухоустойчивым и зимостойким растением, не требующим укрытия на зиму.

Целью настоящей работы была разработка метода микроклонального размножения кизильника Даммера для получения материала, пригодного для создания растущих плантаций.

Материалы и методы исследования

Материал для введения в культуру in vitro, ветви кизильника, брали в осенний период в Ботаническом саду им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета. Типом первичного экспланта был выбран стеблевой сегмент, содержащий пазушную или апикальную почку (рис. 1).

Стерилизацию исходного материала проводили следующим образом: побеги тщательно мыли под проточной водой мягкой губкой с бытовым моющим средством, затем с кизильника срезали листья на половину длины. После этого ветви нарезали на сегменты. Полученные участки стебля с междоузлиями помещали в стеклянную емкость, заливали водопроводной водой, добавляли каплю бытового моющего средства, накрывали марлей и качали на качалке 10 мин. После этого, не снимая марли, материал на 20 мин ставили под проточную воду. По истечении этого времени в емкость с побегами заливали дистиллированную воду и снова качали 10 мин. Следующие этапы проводили в стерильных условиях: материал обрабатывали стерилизующими растворами, после чего по 5 мин троекратно отмывали в стерильной дистиллированной воде на качалке.

Поскольку кизильник Даммера - вечнозеленое растение, осенний материал сильно инфицирован. Для обеззараживания первичных эксплантов поверхностную стерилизацию проводили двумя способами. В первом случае материал помещали на 15 мин в раствор отбеливателя «Белизна» в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:3 соответственно. Второй способ отличается тем, что использовали 4%-й раствор «Белизны», содержащий 0,04% мертиолята, и стерилизовали 20 минут.

После завершения этапа обеззараживания, побеги нарезали в ламинаре на стеблевые сегменты с одной пазушной почкой и сажали в пенициллиновые пузырьки на питательную среду WPM, половинную по макросолевому составу (1/2 WPM) с добавлением 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0,1 мг/л гибберелловой кислоты (ГА₃).

Для поддержания и мультипликации кизильника в пробирочной культуре использовали среду 1/2 WPM с добавлением 0,2 мг/л БАП и 0,1 мг/л ГА₃ или половинную по макросолевому составу среду Мурасиге и Скуга (1/2 MS) [6].

У многих эксплантов на базальной части побега развивалась эндогенная инфекция, от которой при первичной стерилизации невозможно в некоторых случаях полностью избавиться. Для сохранения материала срезали верхнюю часть растущего побега и сажали на среду прежнего состава. Это позволяло выращивать растения из стерильной меристемы экспланта.

Материал для введения кизильника Даммера в стерильную пробирочную культуру in vitro брали в осенний период, что отчасти объясняет трудности получения стерильных эксплантов.

Были испробованы два варианта обеззараживания первичных эксплантов. Результаты показали, что только 7% растений, обработанных стерилизующим раствором, содержащим только «Белизну» в высокой концентрации, сохранились после двух недель культивирования. Во втором случае процент жизнеспособных эксплантов составил 69%. Таким образом, меньшая концентрация хлорсодержащего агента и мертиолят в обеззараживающем растворе способствуют лучшему избавлению от инфекции.

В качестве первичного экспланта использовали узловой сегмент с одной или двумя почками. На начальном этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. Для образования регенерантов все экспланты помещали на половинную по макросолевому составу среду WPM с добавлением 0,2 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л гибберелловой кислоты. Для избавления от эндогенной инфекции, проявлявшейся в базальной части многих первичных эксплантов, регенерант, выросший из меристемы почки, срезали и переносили на питательную среду того же состава. Чтобы не допустить высыхания среды и из-за накопления продуктов жизнедеятельности вокруг погруженной части, экспланты каждую неделю пересаживали на свежие среды.

Было замечено, что добавление 0,2 мг/лБАП и 0,1 мг/л ГА₃ приводит к развитию адвентивных медленнорастущих побегов, а на безгормональной ½ MS происходит активный рост апикальной меристемы главного побега экспланта, что приводит к образованию вытянутого растения с хорошо развитыми листьями и слабым ветвлением. Интересным представляется факт развития цветочных почек и цветение двух образцов в пенициллиновом пузырьке с питательной средой 1/2 WPM + 0,2 мг/л БАП и 0,1 мг/л ГА₃ (рис. 2).

a

б                            в

После трех недель депонирования на описанных средах было получено необходимое для отработки следующего этапа количество эксплантов. Часть растений была пересажена на среды, отличающиеся от исходных гормональным составом: 1/2 WPM + 3 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК) и ½ WPM + 5 ИУК. Через две недели у 5% побегов первого и 30% второго варианта образовались и развились корни (рис. 3).

Укоренившиеся растения in vitro были переведены в условия in vivo (культуры закрытого грунта): посажены в прозрачные пластиковые контейнеры с песком, прогретым в микроволновой печи 30 мин.

На этом этапе происходят многие изменения: переход растений с гетеротрофного на автотрофное питание, развитие устьичного аппарата, адаптация к более сухому воздуху, перепаду температур, утолщение кутикулы и т.п. Эта процедура необходима для пробирочных растений перед помещением их в условия открытого грунта.

а                                                     б                                                    в

Кизильник Даммера - декоративное вечнозеленое растение, эндемик гор центрального Китая, имеет широкое применение в декоративном озеленении. В литературе имеется лишь одно упоминание о микроклональном размножении кизильника, но другого вида - кизильника горизонтального [7]. Нами была подобрана методика стерилизации исходного растительного материала, получены растения in vitro и оптимизированы среды, наиболее подходящие для поддержания и множественной мультипликации в стерильной пробирочной культуре. Выяснено, что для индукции корнеобразования необходимо выдерживание растений на средах, содержащих 5 мг/л ауксина β-индолилуксусной кислоты - фитогормона, стимулятора роста растений. Укоренившиеся in vitro растения успешно адаптированы в закрытом грунте и могут быть использованы для высадки в питомники, на открытые земельные участки.

Работа выполнена в рамках и при поддержке государственного контракта на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» № 16.518.11.7099.

• Дурнова Н.А., д.б.н., профессор, зав. кафедрой общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Ра-
  зумовского» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Саратов;
• Полуконова Н.В., д.б.н., профессор кафедры общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Ра- зумовского» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Саратов.

Работа поступила в редакцию 06.04.2012.

Библиографическая ссылка