Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНА c-fos И ЕГО ЭКСПРЕССИВНАЯ АКТИВНОСТЬ В НОРМЕ И ПРИ ЭНДОТОКСИКОЗЕ

Трофимов В.А. 1 Лопухова Е.Н. 1 Власов А.П. 1
1 ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва»
Изучены некоторые механизмы участия гена c-fos и кодируемого им белкового продукта в развитии эндотоксикоза как осложнения при хирургических заболеваниях. Не получено достоверных доказательств ассоциации полиморфизмов rs2239615 и rs7101, обусловленных однонуклеотидными заменами в 5’-лидерной области гена c-fos, с хронизацией воспалительного процесса и формированием эндотоксикоза как крайней формы заболевания. В то же время показано, что при эндотоксикозе в клетках крови больных в зависимости от тяжести заболевания отмечается повышенный уровень экспрессии гена c-fos по сравнению с нормой, определяемый по накоплению кДНК гена методом обратной транскрипции. Предполагается, что участие гена c-fos в формировании эндотоксикоза как системного заболевания связано с изменением его экспрессируемости и изменением активности контролируемых им генов, влияющих на жизнеспособность и функциональную активность клеток.
ген c-fos
однонуклеотидный полиморфизм
генная экспрессия
эндотоксикоз
1. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: в 2 т. Т.2 / А.И. Карпищенко и др. – СПб.: Интермедика. – 1999. – 656 с.
2. Ли Ч. Введение в популяционную генетику: пер. с англ. Е.А. Салменкова, Е.Я. Тетушкина; под ред. Ю.П. Алтухова, Л.А. Жиотовского. – М.: Мир, 1978. – 555 с.
3. Трофимов В.А. Влияние холестерола на экспрессию генов раннего ответа и метотическую активность перитонеальных макрофагов / В.А. Трофимов, О.Н. Аксенова, А.В. Никулин, М.В. Ромашкина, Е.А. Иванова, А.М. Орешин // Казанский медицинский журнал. – 2009. – Т. 90, № 4. – С. 160–163.
4. Boodram L.-L. Extraction of genomic DNA from whole blood / Protocol Online – Your Lab’s Reference Book – online database of research protocols in a variety of life science fields [Electronic resource]. – Mode of access: http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/Extraction-of-genomic-DNA-from-whole-blood-3171.html (date of access: 10.09.2012).
5. Chinenov Y. Close encounters of many kinds: Fos-Jun interactions that mediate transcription regulatory specificity / Y. Chinenov, and T.K. Kerppola // Oncogene. – 2001. – Vol. 20, No. 19. – P. 2438–2452.
6. dbQSNP Public – Kyushu university genome database [Electronic resource]. – Mode of access: http://qsnp.gen.kyushu-u.ac.jp/STS_info.cgi?stsnum = KG00G2243 (date of access: 15.02.2013).
7. Ensembl – is a joint online project between EMBL – EBI and the Wellcome Trust Sanger Institute [Electronic resource]. – URL: http://www.ensembl.org/index.html (date of access: 15.02.2013).
8. Healy S. Immediate early response genes and cell transformation / S. Healy, P. Khan, J.R. Davie // Pharmacology & Therapeutics – 2013. – Vol. 137. – P. 64–77.
9. Knebel B.A mutation in the c-Fos gene associated with congenital generalized lipodystrophy / B. Knebel, J. Kotzka, S. Lehr, et al. // Orphanet Journal of Rare Diseases. – 2013. – Vol. 8. – Р. 119.
10. McKay S. Pro-inflammatory cytokines induce c-fos expression followed by IL-6 release in human airway smooth muscle cells / S. McKay, M.M.G. Bromhaar, J.C. de Jongste, et al. // Mediators of Inflammation – 2001 – Vol. 10. – P. 135–142.
11. Patino W.D. Circulating transcriptome reveals markers of atherosclerosis / W.D. Patino, O.Y. Mian, Ju-G. Kang, et al. // PNAS – 2005. – Vol. 102, № . 9. – P. 3423–3428.
12. Saliques S. Smoking and FOS expression from blood leukocyte transcripts in patients with coronary artery disease / S. Saliques, J-R. Teyssier, C. Vergely et al. // Atherosclerosis – 2011. – Vol. 219. – P. 931–936.
13. Schlesselman J.J. Case-Control Studies: Design, Conduct, Analysis: Design, Conduct, Analysis (Monographs in epidemiology and biostatistics) / J.J. Schlesselman – New York. : Oxford University Press. – 1982. – 368 p.
14. Yiu W.C. Genetic susceptibility to refractive error: association of vasoactive intestinal peptide receptor 2 (VIPR2) with high myopia in Chinese / W.C. Yiu, M.H. Yap W.Y. Fung, et al. // PLoS One – 2013. – Vol. 8(4) – e61805.

Гены раннего ответа (ГРО) привлекают пристальное внимание исследователей в силу ряда причин. При действии на клетки различных стимулов они включаются первыми и запускают сложные генные сети, формирующие физиологические реакции клетки. Важной особенностью ГРО является консервативность, которая является отражением их ключевой роли в клеточной регуляции. Существенные нарушения, приводящие к деактивации или гиперэкспрессии этих генов, могут быть причиной различных заболеваний, в частности онкологических, связанных с системными нарушениями на организменном уровне [8].

Ярким представителем генов раннего ответа является ген c-fos, который вместе с белком c-Jun, образует транскрипционный фактор АР-1, играющий важную роль в клеточной регуляции [5]. Показано, что изменение экспрессивной активности c-fos может быть связано с атеросклерозом, воспалением дыхательных путей, ишемической болезнью сердца [3, 10–12].

Для понимания механизмов модификации генной экспрессии активно исследуются полиморфные варианты гена c-fos, их влияние на работу гена и активность кодируемого белка. В базе данных ENSEMBL представлено 6 вариантов SNP, из них по пяти генам проведено исследование в рамках 1000 Genomes [7]. Выявлены три наиболее распространённые однонуклеотидные замены: rs1046117, rs2239615 и rs7101. В настоящее время проводится анализ их распространенности при различных заболеваниях [9].

В настоящей работе представлены результаты исследования распространенности полиморфизмов rs2239615, rs7101 в группах доноров и больных с эндотоксикозом, а также экспрессивной активности гена c-fos с целью выявления механизмов, лежащих в основе хронизации воспалительных заболеваний и развития эндотоксикоза.

Материалы и методы исследования

Работу проводили на образцах ДНК и РНК, выделенных из цельной венозной крови доноров и больных с острым аппендицитом, осложненным перитонитом, у которых зарегистрированы явления эндогенной интоксикации различной степени тяжести. Параметрами формирования выборок и оценки эндотоксикоза являлись общепринятые лабораторно-клинические и биохимические показатели [1].

Выделение ДНК проводили по методу L.-L. Boodram (2004) с модификациями [4]. Анализ полиморфизмов проводили методом PCR-SSCP. Амплификацию проводили согласно следующим параметрам: для полиморфизма rs2239615: 95 °С – 180 с, 30 циклов 60 °С – 10 сек, 95 °С – 10 с (длина продукта 95 п.н.); для полиморфизма rs7101: 95 °С – 180 с, 30 циклов 63 °С – 50 с, 95 °С – 20 с (длина продукта 258 п.н.) с использованием специфических праймеров (rs2239615 F.: 5’-GGC GCC TCG TAC TCC AAC C-3’, R.: 5’-GAG CAC GGT CAC TGC TCG TT-3’ [6]; rs7101 F.: 5’-CGA GCA GTG ACC GTG CTC CT-3’, R.: 5’-GAG TGG TAG TAA GAG AGG CTA T-3’ [14]) («Синтол», Россия).

Для анализа экспрессивной активности использовали метод ОТ-ПЦР. РНК выделяли с помощью набора РНК-Экстран («Синтол», Россия). кДНК была синтезирована из тотальной РНК с использованием праймера Олиго(dT) и MMLV-RT («Синтол», Россия). Амплификацию проводили согласно следующим параметрам: 40 циклов 95 °С – 15 с, 60 °С – 40 с, 72 °С – 40 c с использованием специфических праймеров на кДНК c-fos: F 5´-GGA GGA CCT TAT CTG TGC GTG A-3´, R 5´-GAA CAC ACT ATT GCC AGG AAC ACA-3 [12]. Внутренний контроль проводили с использованием ПЦР реакции на ген AKTB, набором фирмы «Синтол».

Ампликоны, синтезированные для анализа SNP, денатурировали в формамиде в течение 6 мин при 96 °С, резко охлаждали на льду для получения однонитевых фрагментов и разделяли в 10 % полиакриламидном геле, содержащем 0,5×ТБЕ, в присутствии глицерола, при температуре 25 °С. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 150 В в течение 8,5 часов для rs7101 и 11 часов для rs2239615. Окраска геля проводилась с помощью бромистого этидия и азотнокислого серебра.

Полученные данные статистически обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Популяционно-генетический анализ проводили стандартными методами [2, 13].

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенное нами исследование SNP показало наличие всех вариантов генотипов в выборках доноров и больных с эндотоксикозом (таблица).

Частота встречаемости аллелей и генотипов по изучаемым полиморфизмам

Выборка

Ген/полиморфизм

Частота генотипов, %

Частота аллелей

χ2

OR аллель (95 %)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Доноры (n = 51)

rs2239615 + 71Т/А

АА

АТ

ТТ

А

Т

0,191

0,74 (0,29–1,75)

45,10

(n = 23)

35,29

(n = 18)

19,61

(n = 10)

0,63

0,37

Больные с эндотоксикозом (n = 41)

51,22

(n = 21)

36,58

(n = 15)

12,20

(n = 5)

0,70

0,30

0,048

Доноры (n = 51)

rs7101 + 146 С/Т

ТТ

ТС

СС

Т

С

0,022

2,19 (0,82–6,21)

70,59

(n = 36)

25,49

(n = 13)

3,92

(n = 2)

0,83

0,17

Больные с эндотоксикозом (n = 41)

43,90

(n = 18)

51,22

(n = 21)

4,88

(n = 2)

0,70

0,30

0,111

Известно, что полиморфизм rs2239615 (14:g.75745551T > A, с.–135T > A, n.21T > A) обусловлен заменой Т/А в 5´-лидерной области 71 нуклеотида от начала единицы транскрипции. Частоты генотипов и аллелей полиморфизма у доноров и больных с эндотоксикозом представлены в таблице. Ассоциации аллеля Т с предрасположенностью к развитию эндотоксикоза нами не выявлено.

Полученные данные соответствуют результатам исследования 1000 Genomes, в котором было показано, что частоты аллелей полиморфизма rs2239615 в целом по миру составили А – 72 %, Т – 28 %, в европейской популяции – 75 и 25 % соответственно.

Полиморфизм rs7101 гена c-fos обусловлен заменой С/Т в 5´-лидерной области 146 нуклеотида от начала единицы транскрипции (14:g.75745626C > T, c.–60C > T, n.96C > T). В исследуемой группе доноров частоты данных аллелей составили Т – 83 % и С – 17 %, в группе больных с эндотоксикозом – 70 и 30 % соответственно (таблица). Выявлена ассоциация аллеля С с предрасположенностью к развитию эндотоксикоза (OR > 1). Однако в целом частоты встречаемости данного аллеля в группе больных с эндотоксикозом соответствуют данным, полученным в исследовании 1000 Genomes. Выявленные нами различия в частотах аллелей могут отражать наличие популяционных особенностей, а также различий в критериях формирования выборок обследуемых.

Таким образом, полученные нами данные не позволяют с абсолютной уверенностью говорить о вкладе полиморфных вариантов гена c-fos в формирование и развитие эндотоксикоза.

Для поиска механизма участия гена c-fos в возникновении эндотоксикоза нами исследована его экспрессивная активность в норме и при эндотоксикозе. Для реализации данной цели нами был проведен анализ уровня мРНК гена c-fos относительно содержания мРНК гена b-актина (AKTB) по накоплению кДНК фрагментов. В норме ген c-fos экспрессируется в малых и недектируемых количествах, при этом он способен быстро активироваться в ответ на внешние воздействия [8].

В целом анализ крови доноров и больных показал относительное увеличение в эксперименте накопления кДНК гена c-fos в клетках в зависимости от тяжести эндотоксикоза (рисунок).

pic_34.wmf

Возрастание относительного содержания кДНК гена c-fos при эндотоксикозе. Примечание: * – достоверность отличия по отношению к уровню в группе доноров при p < 0,01

Так, в группе больных с легкой формой эндотоксикоза (1 группа) содержание кДНК увеличилось в среднем на 9 % относительно контроля и составило 1,097 ± 0,038. При увеличении выраженности эндотоксикоза содержание кДНК возрастало и составляло в среднем 1,128 ± 0,013.

Таким образом, при эндотоксикозе отмечается повышенный уровень экспрессии гена c-fos в клетках крови, что может рассматриваться в качестве одного из механизмов систематизации воспалительного процесса и его хронизации с развитием эндотоксикоза.

Заключение

Эндотоксикоз как следствие воспаления характеризуется глубокими и стабильными нарушениями метаболизма, накоплением продуктов патологического обмена, обладающих токсическим действием и развитием дизрегуляционных процессов в организме. Изучение молекулярных механизмов формирования и развития эндотоксикоза является актуальной задачей биомедицины.

В настоящей работе изучены частоты генотипов и аллелей полиморфизмов гена c-fos у доноров и больных с эндотоксикозом. Нами не выявлено ассоциации полиморфизмов rs7101 и rs2239615 с эндотоксикозом. В то же время показано, что при эндотоксикозе в клетках крови больных отмечается повышенный уровень экспрессивной активности гена по сравнению со здоровыми людьми.

По-видимому, участие гена c-fos в формировании эндотоксикоза как системного заболевания может быть связано с изменением его экспрессируемости, вследствие глубоких биохимических и метаболических изменений в организме, приводящих к нарушению спектра биомолекул, влияющих на работу гена раннего ответа. Изменение экспрессируемости гена c-fos может приводить к изменению уровня экспрессивной активности контролируемых им генов (ngf, DNMT1, NF-kB и других) и изменению активности клеточных процессов, включая регуляцию (или дезрегуляцию) липидного метаболизма, противовоспалительных реакций организма, пролиферативной активности клеток и даже апоптоза, в конечном итоге влияющих на жизнеспособность и функциональную активность клеток.

Рецензенты:

Ледяйкина Л.В., д.м.н., доцент, ГБУЗ РМ «Мордовский республиканский клинический перинатальный центр», г. Саранск;

Шубина О.С., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биологии, географии и методик обучения, ФГБОУ ВПО «МГПИ им. М.Е. Евсевьева», г. Саранск.

Работа поступила в редакцию 16.12.2014.


Библиографическая ссылка

Трофимов В.А., Лопухова Е.Н., Власов А.П. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНА c-fos И ЕГО ЭКСПРЕССИВНАЯ АКТИВНОСТЬ В НОРМЕ И ПРИ ЭНДОТОКСИКОЗЕ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 12-4. – С. 770-773;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=36186 (дата обращения: 23.08.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252