Listeria monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis относятся к возбудителям сапрозоонозов и обладают двойственной (сапрофитной и паразитической) природой, благодаря чему способны существовать как в эндотермных, так и в эктотермных организмах, растительных объектах, а также в почвенной и водной средах. Для них характерен широкий диапазон экологической толерантности, то есть способность выживать в различных условиях. Сведения о длительном существовании и размножении патогенных бактерий в наземных экосистемах довольно обширны [3]. Однако литературные данные об исследованиях их жизнеспособности в воде ограничены и разноречивы [1, 2]. Необходимость изучения этой проблемы очевидна, так как, начиная с конца 80-х годов и до настоящего времени, в ряде стран Европы и Америки отмечаются многочисленные вспышки листериоза, связанные с употреблением в пищу инфицированных морских продуктов [6, 8, 9]. Известно, что высеваемость листерий из морских гидробионтов достаточно высока (10–18 %) [7, 10]. Можно предположить, что патогенные бактерии попадают в морскую среду вместе с паводковыми и грунтовыми водами, вымывающими их из береговых почв, а также со сточными и речными водами. При этом не исключена возможность длительного выживания листерий и иерсиний в морской воде, но неизвестны условия, при которых размножение этих бактерий становится возможным.
Цель работы – определить возможность размножения L.monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis в морской воде при разных температурах, а также изучить влияние метаболитов морских организмов, в частности микроводорослей, на размножение патогенных бактерий в морской среде.
Материал и методы исследования
В качестве объектов исследования были взяты референс-штаммы Listeria топоcytogenes: 2 м, 10 CN, № 546, К, П, А, 1-А (1/2 а и 4b сероварианты), полученные из музея ВГНКИ ветпрепаратов, г. Москва, и штаммы Yersinia pseudotuberculosis 512 и Н-2781 (1b серовариант) из музея Всероссийского центра по иерсиниозу и псевдотуберкулезам (НИИЭМ им. Г.П. Сомова СО РАМН, г. Владивосток). Пробы воды были взяты в октябре в б. Лазурная Японского моря, в 100 м от берега. Стерилизацию морской воды проводили методом фильтрации через ватно-марлевый и бактериальный фильтры. Заражающую дозу, подобранную с помощью стандарта мутности (1000 клеток в 0,1 мл инокулируемой среды для нативной воды, 100 клеток в 0,1 мл среды для стерильной воды), вносили в морскую воду и культивировали при положительных температурах 6–8 и 20–25 °С. Для подсчета выживших в воде бактерий (КОЕ) 0,1 мл инокулированной воды высевали в определенные сроки на чашки Петри с питательной средой (дрожжевой агар с добавлением на 100 мл среды 0,2 % глюкозы, 40 мг налидиксовой кислоты и 0,2 мл 10 % раствора трипофлавина). Адаптированные к низкой температуре штаммы листерий и иерсиний получали путем пятикратного пасcирования микроорганизмов и морской воды в течение одного месяца при температуре 6–8 °С.
Для изучения влияния экзометаболитов морских микроводорослей на размножение листерий и иерсиний был использован метод А.Х. Тамбиева с соавторами [4]. Для эксперимента были взяты альгологически чистые культуры микроводорослей, распространенные в прибрежных водах дальневосточных морей: Bacillariophyta – Skeletonema costatum, Chlorophyta – Chlorella minutissima, Platymonas sp., Cryptophyta – Chroomonas salina. Исключение составила культура Phaeodactylum tricornutum, выделенная из Красного моря, являющаяся универсальным альгологическим тест-объектом. Водоросли культивировали при температуре 20 ± 2°С и освещенности 3000 лк люминесцентными лампами со свето-темновым периодом 12 ч свет/12 ч темнота в питательной среде, приготовленной на основе натуральной стерильной морской воды соленостью 34 ‰. Стадию кривой роста определяли графическим методом (количество колоний выражали в lg). [5]. Экзометаболиты водорослей, взятых в экспоненциальной и стационарной фазах роста, получали центрифугированием в течение 30 минут со скоростью 2000 об/мин. В эксперименте ЭМ водорослей разводили физиологическим раствором 1:10, 1:1000 соответственно, после чего инокулировали L. monocytogenes (заражающая доза 103 КОЕ/мл). Температура культивирования 6–8 °С, время экспозиции 14 суток. Контролем служили кривые роста листерий в среде, используемой для культивирования водорослей, разведенной физиологическим раствором 1:10 и 1:1000 соответственно.
С целью изучения природы веществ, стимулирующих рост бактерий в морской среде, экзометаболиты микроводоросли Рhaeodactylum tricornutum, выращенной как на искусственной, так и на естественной морской воде, получали последовательной экстракцией 1 л фильтрата культуральной жидкости рядом органических растворителей, в порядке возрастания их полярности (по 100 мл гексана, бензола, этилацетата). Экстракты упаривали в вакууме при 40 °С. Контролем служили аналогичные фракции, полученные в результате экстракции 1 л морской воды, как естественной, так и искусственной, пропущенной через бактериальный фильтр. Полученные фракции ЭМ были пропущены через бактериальные фильтры и использованы в качестве сред для культивирования бактерий, при этом заражающая доза бактерий составила 1000 кл/мл культивировали при 22 °С в течение двух недель (срок наблюдения). Рост бактерий определяли на спектрофотометре СФ-24 при длине волны 540 нм.
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе экспериментальных исследований было установлено, что музейные штаммы L. monocytogenes, Y. pseudotuberculosis быстро погибали в нестерильной морской воде при температуре 20–25 °С, но выживали при 6–8 °С (до 3–4 суток в зависимости от штамма). Наиболее устойчивыми к заданным условиям в морской воде оказались штаммы L. monocytogenes 2м, 10CN, наименее устойчивым – штамм L. monocytogenes К. В стерильной морской воде листерии размножались до 103–104 КОЕ/0,1 мл, как при температуре 6–8 °С, так и при 20–25 °С. При температурах выше 8 °С бактерии быстрее достигали максимальной численности, но дольше сохранялись при низкой температуре (до 1 месяца), если в воду вносили адаптированные к низкой температуре и голодным условиям штаммы бактерий и выращивали при температуре 6–8 °С. Следовательно, оптимальными условиями для размножения листерий в естественной морской воде является низкая температура культивирования и адаптированность штамма к условиям среды.
Сравнительные исследования показали, что в образцах фильтрованной морской воды численность сапрофитных микроорганизмов снижается в 106–107 раз по сравнению с естественной морской водой, что позволяет патогенным бактериям не только длительно сохраняться, но и размножаться в фильтрованной морской воде. Следовательно, в холодное время года, когда количество сапрофитных бактерий в морской воде резко снижается, конкурентоспособность возбудителей сапрозоонозов, обладающих психрофильными свойствами, значительно возрастает. В связи с этим можно предполагать, что поздняя осень и ранняя весна являются наиболее вероятным временем для заражения гидробионтов, в том числе и широко используемых в пищу человеком.
Изучение влияния ЭМ морских микроводорослей показало, что ЭМ из экспоненциальной фазы роста нейтральны по отношению к L. monocytogenes. ЭМ середины стационарной фазы роста микроводорослей стимулируют размножение листерий. Лучше всего листерии размножались на ЭМ зеленых и криптомонадовых водорослей, при этом концентрации бактерий в указанных условиях к 14 суткам культивирования превышали контроль на 2,3 и 2,5 lg соответственно. Значительно меньше стимулировали рост бактерий ЭМ диатомовой водоросли. В данном случае количество бактерий за тот же период культивирования увеличилось лишь на 1,7 lg по сравнению с контролем. Стимулирующее влияние ЭМ микроводорослей, взятых из стационарной фазы роста по-видимому, заключается в том, что в стационарной фазе роста клетки микроводорослей выделяют больше метаболических органических веществ, чем в экспоненциальной фазе.
В результате проведенных серий экспериментов было показано, что через 18 часов культивирования фракции Р. tricornutum (гексановая, бензольная, этилацетатная) стимулировали размножение L. monocytogenes 4b сероварианта на 40,4; 30 и 28 % соответственно по сравнению с контролем. При этом роста клеток 1/2а сероварианта на этих субстратах не наблюдали. У иерсиний не было отмечено стимулирующего эффекта полученных фракций (20; 10 и 0 % соответственно). Использование же в качестве среды культивирования для водорослей искусственной морской воды показало результаты прямо противоположные предыдущим. Так фракции метаболитов водоросли Р. tricornutum, выращенной на искусственной морской воде симулировали размножение иерсиний на шестые сутки в следующей последовательности: этилацетат – 60 %, бензол – 30 %, гексан – 0 %. Размножения листерий на этих фракциях не наблюдали.
Заключение
Патогенные бактерии – возбудители сапрозоонозов способны не только существовать в морской среде, но и размножаться при определенных условиях. При этом они могут инфицировать гидробионты, в том числе и промысловые виды в цепи питания через микроводоросли, которые способны стимулировать их размножение. Биологическая активность ЭМ морских микроводорослей в отношении L. monocytogenes зависит от видовой принадлежности водорослей и стадии развития альгокультуры. Можно предположить, что механизм стимуляции роста грамположительных и грамотрицательных бактерий ЭМ различен. В фильтратах естественной морской воды содержится большое количество экзометаболитов различных морских обитателей (водоросли, гидробионты, морские микроорганизмы и т.д.) и, как показал наш анализ, превалируют в них в основном вещества липидной природы, экстрагируемые гексаном. Последние стимулируют рост грамположительных листерий в лаг фазе, но практически не влияют на размножение грамотрицательных иерсиний. Экзометаболиты, выделяемые в среду микроводорослью Р. tricornutum, стимулирующие рост Y. pseudotuberculosis в логарифмической стадии (то есть влияют непосредственно на скорость деления бактерий), имели в основном белковую природу.
Рецензенты:Мартынова А.В., д.м.н., профессор кафедры эпидемиологии и военной эпидемиологии, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России, г. Владивосток;
Кузнецова Т.А., д.б.н., зав. лабораторией иммунологии, ФГБУ «НИИЭМ им. Г.П. Сомова СО РАМН», г. Владивосток.
Работа поступила в редакцию 26.11.2014.
Библиографическая ссылка
Бузолева Л.С., Бузолева Л.С., Кривошеева А.М., Богатыренко Е.А., Богатыренко Е.А., Ким А.В. ФАКТОРЫ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ ВЫЖИВАНИЮ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПРОЗООНОЗОВ В МОРСКОЙ СРЕДЕ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 11-11. – С. 2426-2428;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35959 (дата обращения: 18.04.2024).