Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ HANTAAN И AMUR И ВЫЗЫВАЕМЫХ ИМИ ИНФЕКЦИЙ В МОДИФИЦИРОВАННЫХ ТЕСТАХ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Кушнарева Т.В. 1 Компанец Г.Г. 1
1 ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН
Показана эффективность предложенных модификаций теста торможения гемагглютинации для идентификации близкородственных хантавирусов Amur и Hantaan и вызываемых ими инфекций при исследовании материала от грызунов-носителей и больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС). Типирование сывороток крови от больных ГЛПС в постановке РТГА с 2 АЕ антигена (время контакта 15 минут и 2 часа при + 4 °С) серологически подтвердило установленную с помощью молекулярно-генетических исследований эпидемиологическую значимость трех хантавирусов – Amur, Hantaan и Seoul – в заболеваемости ГЛПС на территории Приморского края. Количественная оценка антигенного родства штаммов генотипов Amur и Hantaan, выделенных от их резервуарных хозяев Apodemus peninsulae и Apodemus agrarius соответственно, была проведена с помощью кинетической РТГА (4 АЕ; контакт 15 и 30 минут, 1, 2, 4 и 20 часов при + 4 °С). Установленные межтиповые антигенные различия между вирусами Amur, Hantaan, Seoul и Puumala продемонстрировали антигенную самостоятельность вируса Amur как отдельного серотипа в роду Hantavirus. Возможность ранней этиологической серодиагностики ГЛПС имеет большое практическое значение на эндемичных территориях с циркуляцией нескольких патогенных хантавирусов.
хантавирус
хантавирусные инфекции
геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС)
диагностика
тест торможения гемагглютинации
1. Кушнарева Т.В. Гемагглютинирующие свойства хантавирусов и получение специфического диагностикума: автореф. дис. ... канд. биол. наук. – Владивосток, 2002. – 25 с.
2. Кушнарева Т.В., Слонова Р.А., Компанец Г.Г. Способ получения диагностикума хантавирусов. – Патент России № 2180754. 2002. Бюл. № 8.
3. Слонова Р.А., Кушнарева Т.В., Компанец Г.Г. Современные аспекты природной очаговости хантавирусной инфекции в Приморском крае // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2008. – № 2. – С. 5–9.
4. Слонова Р.А., Кушнарева Т.В., Компанец Г.Г. Хантавирусная инфекция в Приморском крае – эпидемиологическая ситуация в очагах циркуляции разных серотипов вируса // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунол. – 2006. – № 3. – С. 74–77.
5. Яшина Л.Н. Генетическая характеристика хантавирусов, циркулирующих в Приморском крае // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. – 2006. – № 3. – С. 78–80.
6. Вrummer-Korvenkontio M., Manni T., Ukkonen S. Detection hemagglutination – inhibition antibodies in patients with Nephropathia Epidemica and Korean hemorrhagic fever by using Puumala virus cell culture antigen // J. Infect. Dis. – 1986. –Vol. – 15. – P. 997–998.
7. Kosoy M. E., Slonova R. A., Mills J. et al. Community structure and prevalence of Hantavirus infection in rodents a geographic division of the enzootic area in Far Eastern Russia // J. Vect. Ecol. 1997. – Vol. 22., Iss. 1. – P. 52–63.
8. Lee H.W., Lee P.W., Jonson K. Isolation of etiologic agent of Korean hemorrhagic fever // J. Infect, Dis. – 1978. – Vol. 137. – P. 298–308.
9. Manual of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome and Hantavirus Pulmonary Syndrome / Lee H.W., Calisher C., Schmaljohn C. Korea, Seoul: WHO Collaborating Center, 1998. 258 p.
10. Okuno Y., Yamanishi K., Takahashi M. et al. Hemagglutination-inhibition test for hemorrhagic fever with renal syndrome using antigen prepared from infected culture fluid // J. Gen. Virol. – 1986. – Vol. 67. – P. 149–156.
11. Tsai T.F., Tang Y.W., Hu S.L. et al. Hemagglutination-ingibition antibody in hemorrhagic fever with renal syndrome // J. Infect. Dis. –1984. – Vol. 150. – P. 895–898.

Основными видами диагностики вирусных инфекционных заболеваний, несмотря на разнообразие современных методов лабораторных исследований, остаются серологические тесты и классический метод выделения вирусов на культуре клеток. Успех своевременной этиологической диагностики хантавирусных инфекций в значительной степени зависит от разработки новых и совершенствования рутинных иммунологических методов исследования. Трудности, связанные с выделением на культуре клеток хантавирусов от больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС) и грызунов-носителей, выдвигают на первое место серологические тесты. Для выявления специфических антител к определенному вирусу чаще всего используют метод непрямой иммунофлюоресценции (НМФА). К вирусам, обладающим гемагглютинирующими свойствами, применяют также и иммунологическую реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), которая основана на способности сывороточных антител, вырабатываемых к гемагглютининам (специфическим белкам, содержащимся во внешней оболочке некоторых вирусов), подавлять вызываемую вирусом агглютинацию эритроцитов. После успешной изоляции прототипного штамма 76-118 вируса Hantaan [8] рН-зависимые гемагглютинины были выявлены в антигенах, полученных из мозга новорожденных мышей, клеток VERO E-6, вируссодержащих культуральных жидкостей [6, 10, 11]. Чувствительность и специфичность тестов гемагглютинации в значительной степени зависит от источника и способа получения антигенов, при этом условия репродукции вирусов оказывают заметное влияние на формирование гемагглютининов, а воздействие физических и химических факторов влияет на функциональные свойства антигенов и их стабильность [1, 10]. Было отмечено [9], что тест РТГА по своей специфичности не уступает реакции нейтрализации с использованием тканевых культур, а его применение предпочтительнее в тех регионах, где одновременно циркулируют несколько антигенных вариантов хантавирусов. На территории Приморского края с помощью молекулярно-генетических методов исследования выявлена циркуляция трех патогенных хантавирусов – Hantaan (геновариант FE), Amur и Seoul (геновариант VDV), природными хозяевами для которых установлены восточный подвид полевой мыши (Apodemus agrarius), восточно-азиатская мышь (Apodemus peninsulae) и серая крыса (Rattus norvegicus) соответственно [3–5].

Цель работы – показать эффективность модифицированных тестов торможения гемагглютинации при идентификации штаммов близкородственных вирусов Amur и Hantaan (геновариант FE), изолированных от экологически разных видов мышей рода Apodemus – A. peninsulae и A. agrarius соответственно, а также случаев заболевания ГЛПС, обусловленных этими патогенами, на территории Приморского края.

Материал и методы исследования

Гемагглютинирующие антигены штаммов – прототипных и выделенных нами на клеточной культуре VERO E-6 от грызунов-носителей хантавирусов на территории края – готовили из вируссодержащих культуральных жидкостей по разработанному способу [2]. Исследовали сыворотки крови от инфицированных хантавирусом грызунов (n = 86) и больных ГЛПС (n = 246) из трех очаговых регионов края (I – Восточно-Маньчжурский холмисто-равнинный, II – Амуро-Уссурийский предгорно-лесной, III – Сихотэ-Алиньский горно-таежный [7]) и г. Владивостока. Все больные были с серологически подтвержденным в НМФА диагнозом ГЛПС без четкого различия в титрах антител к вирусам Hantaan, Amur и Seoul. Гемагглютинирующую активность антигенов определяли в реакции гемагглютинации (РГА). Этиологическую диагностику ГЛПС у больных из разных регионов края и в разные сроки заболевания проводили в условиях модифицированной постановки РТГА – 2 активные единицы антигена (АЕ), время контакта 15 минут и 2 часа при +4 °С. Антигенные связи штаммов хантавирусов изучали в предложенной кинетической постановке РТГА (КРТГА) – 4 АЕ антигена, время контакта 15 и 30 минут, 1, 2, 4 и 18 часов при + 4 °С (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика тестов гемагглютинации, используемых в работе

Реакции

Характеристика реакций

Реакция гемагглютинации (РГА)

Определение гемагглютинирующей активности антигенов и их рабочей дозы – 4-8 АЕ

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Оценка специфической гемагглютининингибирующей активности антител (антигемагглютининов) в сыворотках крови больных ГЛПС по ? 4-кратной разнице в титре антител к антигенам гомо- и гетерологичных хантавирусов

Кинетическая реакция торможения гемагглютинации (КРТГА)

Проведение серологической идентификации штаммов хантавирусов с учетом кинетики взаимодействия антигемагглютининов иммунных сывороток крови, полученных к серотипам Hantaan (HTNV), Amur (AMRV), Seoul (SEOV) и Puumala (PUUV), с гомо- и гетерологичными гемагглютинирующими антигенами хантавирусов

Внутри- и межтиповые антигенные отношения исследуемых штаммов хантавирусов оценивали в перекрестных КРТГА, при этом степень антигенного сходства или различия штаммов количественно определяли по рассчитанному в каждой реакции значению предложенного ранее показателя А [1].

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе изучали эффективность теста РТГА для дифференциальной диагностики хантавирусных инфекций среди разных видов – носителей хантавирусов. Часть результатов параллельного титрования сывороток крови от инфицированных животных с гемагглютинирующими антигенами разных хантавирусов представлена в табл. 2. Специфические антитела чаще выявляли к тому хантавирусу, для которого данный вид животного является основным хозяином. В ряде случаев отмечали перекрестные реакции с гетерологичными вирусами, но титр антител к гомологичному вирусу был выше.

Таблица 2

Идентификация хантавирусной инфекции у грызунов-носителей в РТГА

Вид грызуна

Номер исследуемой сыворотки

Гемагглютинирующий антиген хантавируса / грызун-носитель

HTNV

(Apodemus agrarius)

AMRV

(A. peninsulae)

HOKV

(Myodes rufocanus)

VLАV

(Microtus fortis)

Apodemus agrarius

9189

9400

9564

9735

10360

10385

11007

10 – 640*

20

160

160

40

160

160

40

< 10–40

< 10

10

40

< 10

40

40

10

< 10–40

< 10

10

20

< 10

10

40

< 10

< 10–10

< 10

20

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

Apodemus peninsulae

5303

6670

7036

8535

9473

10497

10544

10619

10977

11050

11660

< 10–40

10

< 10

20

10

40

40

40

10

20

< 10

< 10

10–320

40

40

160

80

160

320

160

80

80

40

20

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

Myodes rufocanus

11525

10

< 10

80

20

Microtus fortis

9469

< 10

< 10

10

40

Примечание.* – титр антигемагглютининов (гемагглютининингибирующих антител).

При исследовании сывороток крови от восточно-азиатских мышей из лесных ландшафтов края СГТ антител с антигеном штамма от A. peninsulae был в 2 раза выше по сравнению с антигеном штамма от A. agrarius – 4,6 log2 и 2,3 log2 соответственно. В то же время при титровании сывороток крови полевых мышей из степных и лесостепных ландшафтных зон было получено более высокое значение СГТ антител с антигеном штамма от A. agrarius, чем с антигеном штамма от A. peninsulae – 5,7 log2 и 3,2 log2 соответственно.

На следующем этапе изучалась диагностическая эффективность модифицированной постановки РТГА для дифференциации хантавирусных инфекций у больных из разных очаговых регионов в период высокой заболеваемости ГЛПС на территории края (табл. 3).

Таблица 3

Типирование хантавирусной инфекции у больных ГЛПС из разных очаговых регионов Приморского края в модифицированной РТГА

Эпидемиологический тип очагов ГЛПС

Очаговый регион

Обследовано больных ГЛПС

Случаи ГЛПС, обусловленные вирусом *

Случаи ГЛПС не идентифицированы **

Hantaan

Amur

Seoul

Сельский тип:

I очаговый регион

II и III регионы

67

21

46

19

14

5

39

3

36

н/о

н/о

н/о

9

4

5

Городской тип

29

2

5

20

2

В целом по краю

96

21

44

20

11

Примечания: * – идентификация хантавирусных инфекций по ? 4-кратной разнице в титрах гемагглютининингибирующих антител в сыворотках крови к гомологичному и гетерологичным хантавирусам; ** – < 4-кратная разница в титрах антител к используемым гемагглютинирующим антигенам хантавирусов; н/о – не определено. Очаговые регионы: I – Восточно-Манчжурский холмисто-равнинный; II – Амуро-Уссурийский предгорно-лесной; III – Сихотэ-Алинский горно-таежный.

Amur-вирусная инфекция составила 45,8 ± 5,1 % случаев заболевания (в основном, у жителей II и III очаговых регионов), Hantaan-вирусная инфекция – 21,9 ± 4,2 % случаев (большей частью у жителей I очагового региона), Seoul-вирусная инфекция – 20,8 ± 4,1 % случаев (у жителей г. Владивостока). В 11,5 ± 3,3 % случаев этиологический агент не был установлен. Важно отметить, что при типировании сывороток крови от больных ГЛПС из г. Владивостока, помимо преобладающей Seoul-вирусной инфекции (69,0 ± 8,6 %), были идентифицированы Amur- и Hantaan-вирусные инфекции (17,2 ± 7,0 и 6,9 ± 4,7 % соответственно).

Основной этап нашей работы был посвящен количественной оценке антигенных различий между штаммами близкородственных вирусов Amur и Hantaan (геновариант FE), выделенных от экологически разных видов A. peninsulae и A. agrarius соответственно, с помощью перекрестной кинетической РТГА (табл. 4).

Таблица 4

Результаты идентификации штаммов хантавирусов, изолированных от экологически разных видов мышей рода Apodemus, в кинетической РТГА

Гемагглютинирующие антигены штаммов хантавирусов

Иммунные сыворотки к прототипным штаммам хантавирусов

Hantaan 76-118

HTNV

CG-1820

PUUV

SR-11

SEOV

Вирус Hantaan:

штамм 76–118

штаммы от Apodemus agrarius

1*

0,58–0,60

0,01

0,01

0,18

0,13–0,18

Вирус Puumala:

штамм CG–1820

0,05

1*

0,04

Вирус Seoul:

штамм SR–11

0,2

0,01

1*

Вирус Amur:

штаммы от Apodemus peninsulae

0,27–0,29

0,01

0,25–0,27

Примечания: * – значения показателя А: 1 – соответствует гомологичной связи, десятичная дробь – гетерологичной связи. Значения показателя А от 1 до 0,3 соответствуют внутритиповым антигенным различиям; значения показателя А меньше 0,3 – межтиповым

Значения показателя А для гемагглютинирующих антигенов штаммов вируса Hantaan (геновариант FE) в кинетических реакциях с иммунной сывороткой к прототипному штамму Hantaan 76–118 варьировали в узком диапазоне 0,58–0,6, свидетельствуя об антигенном сходстве штаммов от полевых мышей в пределах одного серотипа Hantaan. Антигены штаммов вируса Amur, изолированные от восточно-азиатских мышей, проявили выраженное межтиповое серологическое отличие со штаммом Hantaan 76–118, имея числовые значения показателя А меньше 0,3 (0,27–0,29), которые соответствуют антигенным отношениям разных серотипов. В кинетических реакциях с иммунной сывороткой к прототипному штамму вируса Seoul антигены штаммов от мышей рода Apodemus ингибировались в меньшей степени, имея значения показателя А, соответствующие межтиповым отношениям: у A. agrarius от 0,13 до 0,18, у A. peninsulae от 0,25 до 0,27. С иммунной сывороткой к прототипному штамму вируса Puumala серологической связи у Amur- и FE–подобных штаммов не выявлено. Таким образом, штаммы вируса Amur продемонстрировали межтиповые антигенные различия со штаммами близкородственных вирусов Hantaan и Seoul, показав в кинетической РТГА с иммунными сыворотками к прототипным штаммам этих вирусов выраженное серологическое отличие (А < 0,3).

На завершающем этапе показана возможность использования модифицированного теста торможения гемагглютинации при ранней дифференциальной диагностике ГЛПС, обусловленной близкородственными вирусами Hantaan и Amur (табл. 5). Парные сыворотки крови, взятые в периоды острого заболевания, ранней и поздней реконвалесценции, титровались с гемагглютинирующими антигенами хантавирусов разных серотипов. При этом эффективность теста при установлении этиологического агента была значительно выше в острый период болезни по сравнению с периодом поздней реконвалесценции.

Таблица 5

Эффективность постановки этиологического диагноза ГЛПС в разные периоды заболевания с помощью модифицированной РТГА

Периоды болезни

Неделя от начала заболевания

Сыворотки крови от больных ГЛПС

обследовано

N

с ≥ 4-кратно превышающим титром антигемагглютининов к гомологичному вирусу

n

M + m (%)

Острый период / 1–2 неделя

102

89

87,2 ± 3,3

Период ранней реконвалесценции / 3 неделя

96

70

72,9 ± 4,5

Период поздней реконвалесценции / 4–5 неделя

48

18

37,5 ± 7,0

Многообразие хантавирусов – род Hantavirus в настоящее время в общей сложности включает более 40 видов, из которых 22 считаются патогенными для человека – вызывает большой интерес к изучению их антигенных связей. Как известно, критерием для типовой идентификации хантавирусов являются различия, установленные с помощью генетического и филогенетического анализов, или ? 4-кратная разница в титре антител с гомо- и гетерологичными вирусами в реакции нейтрализации. Существенным недостатком реакции нейтрализации являются трудоемкость и длительность получения результатов в связи с замедленной репликацией хантавирусов; в обычной постановке РТГА довольно трудно установить различия между штаммами хантавирусов, имеющих близкие генетические связи между собой. Более высокая специфичность кинетической РТГА, по сравнению с РТГА, проявилась при изучении антигенных взаимосвязей близкородственных хантавирусов. Использование кинетической РТГА позволило выявить межтиповые антигенные различия между вирусами Amur и Hantaan (геновариант FE). Значительные отличия вируса Amur от других хантавирусов, выявленные на геномном уровне [12], дают основание предположить, что учет кинетики взаимодействия антител иммунных сывороток с гомо- и гетерологичными гемагглютинирующими антигенами позволяет в определенной степени оценивать различия в генных продуктах М-сегмента – оболочечных гликопротеинах Gn и Gc (ранее G1 и G2, которые менее консервативны, чем нуклеокапсидный белок N. Данные типирования сывороток от больных ГЛПС тестами торможения гемагглютинации подтвердили эпидемиологическую значимость трех вирусов – Amur, Hantaan (геновариант FE) и Seoul – в заболеваемости ГЛПС на территории Приморского края, согласуясь с результатами молекулярно-генетических исследований образцов РНК из крови больных ГЛПС и органов инфицированных диких животных [3, 4].

Заключение

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали эффективность применения модифицированных тестов торможения гемагглютинации при изучении и идентификации близкородственных хантавирусов и вызываемых ими инфекций. Количественная оценка серологических связей штаммов хантавирусов в кинетической постановке РТГА выявила межтиповые антигенные отличия вируса Amur от серотипов Hantaan, Seoul и Puumala, указывая на самостоятельность вируса Amur в качестве отдельного серотипа в роду Hantavirus. Подтверждена эпидемиологическая значимость трех серотипов хантавирусов – Amur, Hantaan и Seoul – в заболеваемости ГЛПС на территории Приморского края. Возможность проведения ранней этиологической серодиагностики ГЛПС имеет большое практическое значение при выборе тактики ведения и лечения больных, а также научном планировании и организации противоэпидемических мероприятий на эндемичных территориях с природными очагами циркуляции нескольких патогенных хантавирусов.

Рецензенты:

Коршукова О.А., д.м.н., профессор, руководитель научного отдела, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владивосток;

Зайцева Е.А., д.м.н., профессор кафедры микробиологии и вирусологии, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владивосток.

Работа поступила в редакцию 06.10.2014.


Библиографическая ссылка

Кушнарева Т.В., Компанец Г.Г. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ HANTAAN И AMUR И ВЫЗЫВАЕМЫХ ИМИ ИНФЕКЦИЙ В МОДИФИЦИРОВАННЫХ ТЕСТАХ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 11-2. – С. 329-334;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35522 (дата обращения: 28.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674