Распространение заболеваний, вызываемых резистентными к действию антибиотиков бактериями, требует совершенствования способов лечения соответствующих больных, а также вызывает необходимость изучения факторов формирования антибиотикорезистентности и методов ее преодоления [5]. Одними из широко применяемых в настоящее время антибиотиков являются аминогликозиды, входящие в перечень препаратов первого ряда при сепсисе и ряде других инфекционных заболеваний [1, 2]. Аминогликозиды наряду с карбапенемами и ингибиторозащищенными цефалоспоринами относятся к препаратам, применяемым для лечения инфекционных заболеваний, вызванных Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., а также представителями семейства Enterobacteriaceae [6]. Нерациональное использование аминогликозидов в течение длительного времени привело к широкому распространению резистентных штаммов, затрудняющему проведение эффективной фармакотерапии с использованием этого класса антибиотиков. В Российской Федерации уровень резистентности к аминогликозидам (прежде всего к гентамицину) превышает таковой по сравнению с большинством развитых стран [4].
Хотя кишечная палочка является основным представителем нормальной микрофлоры толстого кишечника человека, она способна вызывать широкий спектр инфекционных заболеваний – кишечных инфекции, неонатального менингита, пневмонии, инфекций мочевыводящих путей, холецистита, бактериемии. Кроме того, Escherichia coli может являться причиной септического артрита, эндофтальмита, гнойного тиреоидита, синусита, остеомиелита, эндокардита, инфекций кожи и мягких тканей; 12–50 % внутрибольничных инфекций и 4 % случаев кишечных инфекций вызывается кишечной палочкой [7].
В связи с признанием универсальной роли усиления процессов свободнорадикального окисления в патогенезе различных заболеваний, в т.ч. инфекционных, в качестве вспомогательной терапии больным с бактериальными инфекциями могут назначаться антиоксиданты. Таким образом, в традиционную химиотерапевтическую схему «макроорганизм – антимикробное средство – микроорганизм» включается дополнительное лекарственное вещество, влияние которого на микроорганизм-возбудитель в подавляющем большинстве случаев не учитывается.
Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка влияния некоторых антиоксидантов (восстановленный глутатион, N-ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, метилэтилпиридинол) на развитие штамма Escherichia coli ATCC25922 и его чувствительность к гентамицину.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на штамме Escherichia coli ATCC25922. Из указанного штамма готовили суточные культуры инкубацией на скошенном агаре при 35 °С, которые использовали для приготовления инокулятов – бактериальных суспензий в 0,9 % растворе хлорида натрия с оптической плотностью 1,0 по Мак-Фарланду. Перед инокуляцией методом разведения определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) гентамицина. Для инкубации готовили смесь на основе минеральной питательной среды M9. В первой серии эксперимента в среду добавлялись изучаемые антиоксиданты (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, метилэтилпиридинол) до конечных концентраций 0,25, 0,5, 1, 2 и 4 мМ. Во второй серии помимо антиоксидантов также добавлялся гентамицин до сублетальной концентрации (0,3 мг/л), составляющей 50 % ранее определенной МПК. После инокуляции бактериальной суспензии смесь инкубировали в воздушном термостате при 35 °С в течение 24 часов. Для оценки развития штаммов использовали аппарат для определения оптической плотности бактериальных взвесей Densi-la-meter (Erba Lachema s.r.o., Чехия). Полученные данные сравнивали с данными контрольных инкубационных смесей. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметического критерия Манна–Уитни с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc., США), различия считали значимыми при P < 0,05 (в табл. 1 и 2 уровень статистической значимости указан в верхнем индексе после значения) [3].
Результаты исследования и их обсуждение
В табл. 1 представлены результаты изучения влияния антиоксидантов на развитие изучаемого штамма. Как видно из представленных данных, лог-фаза развития культуры в заданных условиях начинается между четвертым и восьмым часом эксперимента. На восьмом часу инкубации впервые становится явным значимое пробактериальное действие восстановленного глутатиона в концентрациях 0,25 и 0,5 мМ, сохраняющееся до окончания опыта. В инкубационных смесях, содержащих глутатион в концентрации 1 мМ, значимое повышение оптической плотности бактериальной биомассы по сравнению с контролем отмечается лишь через восемь и через двенадцать часов. С дальнейшим увеличением концентрации глутатиона пробактериальный эффект антиоксиданта сменяется на антибактериальный. Так, к 24 часу инкубации оптическая плотность бактериальной суспензии, содержащей глутатион в концентрации 4 мМ, ниже контрольной на 9 %. Глутатион является естественным метаболитом кишечной палочки, и, следовательно, может использоваться в обмене веществ. Однако высокие концентрации глутатиона оказываются токсичными для бактерии, что, по-видимому, объясняется нарушением окислительно-восстановительных процессов. Похожим влиянием на рост бактериальной культуры обладает аскорбиновая кислота. По сравнению с глутатионом в минимальных концентрациях она не вызывает ни эпизодического, ни закономерного усиления развития штамма.
N-ацетилцистеин, являясь, как и глутатион, носителем активных сульфгидрильных групп, обладает слабо выраженным влиянием на развитие кишечной палочки. Слабое, но статистически значимое повышение оптической плотности бактериальных суспензий к 24 часу инкубации наблюдается в присутствии N-ацетилцистеина в концентрациях 0,5–2 мМ.
Выраженным антибактериальным действием обладает метилэтилпиридинол. Закономерное угнетение развития культуры Escherichia coli, степень которого прямо пропорциональна концентрации антиоксиданта, наблюдается с восьмого часа инкубации. К окончанию эксперимента оптическая плотность инкубационной смеси, содержащей метилэтилпиридинол в наибольшей концентрации (4 мМ), значимо меньше контрольной на 19,5 %.
Из табл. 2 видно, что все изучаемые антиоксиданты ослабляют антибактериальное действие гентамицина. Эффект носит явную прямо пропорциональную зависимость от концентрации каждого из антиоксидантов в инкубационной среде. Особенно выраженной антагонистической активностью по отношению к гентамицину обладает метилэтилпиридинол, который, как описано выше, обладает антибактериальной активностью.
Одним из возможных механизмов снижения чувствительности к гентамицину под действием тиоловых антиоксидантов (глутатион, N-ацетилцистеин) может быть биотрансформация антибактериального средства при участии глутатион-S-трансферазы, в результате которой в бактериальных клетках образуются конъюгаты антиоксидантов и гентамицина [10, 12]. Но гентамицин не содержит активных электрофильных групп, поэтому, вероятно, реакции конъюгации подвергается продукт N-ацетилирования антибиотика. Описанный механизм подтверждается на примере бактерий Mycobacterium smegmatis, которые синтезируют аналог глутатиона микотиол, и микотиол-дефицитные штаммы микроорганизма проявляют гиперчувствительность к антибактериальным средствам [11].
Таблица 1
Влияние аскорбиновой кислоты на развитие культуры Escherichia coli ATCC25922
|
Концентрация антиоксиданта |
Оптическая плотность бактериальной биомассы, Me(25 %;75 %)P,усл. ед. по Мак-Фарланду |
|||
|
4 часа |
8 часов |
12 часов |
24 часа |
|
|
0 (контроль) |
0,3(0,3;0,4) |
2,6(2,6;2,9) |
4,3(4,2;4,3) |
4,1(4,1;4,2) |
|
Восстановленный глутатион |
||||
|
0,25 мМ |
0,4(0,3;0,4)0,313 |
3,1(3,0;3,2)0,035 |
4,5(4,4;4,6)0,010 |
4,4(4,2;4,4)0,021 |
|
0,5 мМ |
0,3(0,3;0,4)0,765 |
3,1(3,0;3,1)0,040 |
4,6(4,5;4,7)0,002 |
4,4(4,4;4,4)0,002 |
|
1 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,011 |
3,0(3,0;3,0)0,061 |
4,6(4,5;4,6)0,003 |
4,2(4,2;4,3)0,067 |
|
2 мМ |
0,3(0,3;0,4)0,765 |
2,4(2,4;2,4)0,003 |
4,5(4,4;4,5)0,004 |
4,0(3,9;4,0)0,010 |
|
4 мМ |
0,4(0,4;0,4)0,090 |
1,8(1,7;2,0)0,002 |
3,9(3,9;3,9)0,002 |
3,7(3,6;3,8)0,002 |
|
Аскорбиновая кислота |
||||
|
0,25 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,750 |
2,6(2,6;2,7)0,795 |
4,3(4,3;4,3)0,946 |
4,2(4,1;4,2)0,342 |
|
0,5 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
2,4(2,4;2,4)0,003 |
4,2(4,2;4,3)0,384 |
4,1(4,1;4,1)0,162 |
|
1 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
2,6(2,5;2,6)0,143 |
4,2(4,2;4,2)0,042 |
4,0(4,0;4,1)0,134 |
|
2 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
2,3(2,3;2,3)0,003 |
4,2(4,1;4,2)0,016 |
4,0(3,9;4,0)0,010 |
|
4 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
2,4(2,4;2,5)0,009 |
3,9(3,8;3,9)0,002 |
3,7(3,6;3,8)0,002 |
|
N-ацетилцистеин |
||||
|
0,25 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
2,7(2,6;2,8)0,899 |
4,4(4,2;4,4)0,336 |
4,2(4,1;4,2)0,342 |
|
0,5 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,750 |
2,7(2,6;2,8)0,899 |
4,4(4,3;4,4)0,079 |
4,2(4,2;4,2)0,025 |
|
1 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,750 |
2,7(2,6;2,8)0,900 |
4,3(4,3;4,4)0,167 |
4,2(4,2;4,3)0,015 |
|
2 мМ |
0,4(0,3;0,4)0,313 |
2,9(2,9;3,0)0,104 |
4,3(4,2;4,3)0,738 |
4,3(4,2;4,3)0,008 |
|
4 мМ |
0,4(0,3;0,4)0,313 |
2,9(2,9;3,0)0,120 |
4,0(4,0;4,0)0,002 |
3,9(3,9;4,1)0,092 |
|
Метилэтилпиридинол |
||||
|
0,25 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,750 |
2,7(2,6;2,8)0,899 |
4,2(4,2;4,2)0,099 |
4,1(4,1;4,1)0,455 |
|
0,5 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
2,6(2,6;2,6)0,386 |
4,2(4,2;4,2)0,027 |
4,0(3,9;4,0)0,010 |
|
1 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,750 |
2,6(2,5;2,6)0,182 |
4,1(4,1;4,1)0,002 |
4,0(3,9;4,0)0,010 |
|
2 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
2,4(2,3;2,5)0,003 |
3,9(3,9;3,9)0,002 |
3,8(3,7;3,8)0,002 |
|
4 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,217 |
2,2(2,2;2,2)0,002 |
3,7(3,7;3,7)0,002 |
3,3(3,2;3,3)0,002 |
Таблица 2
Влияние аскорбиновой кислоты на активность гентамицина (0,3 мг/л) в отношении культуры Escherichia coli ATCC25922
|
Концентрация антиоксиданта |
Оптическая плотность бактериальной биомассы, Me(25 %;75 %)P,усл. ед. по Мак-Фарланду |
|||
|
4 часа |
8 часов |
12 часов |
24 часа |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
0 (контроль) |
0,1(0,0;0,1) |
0,1(0,1;0,1) |
0,2(0,2;0,2) |
3,7(3,7;4,1) |
|
Восстановленный глутатион |
||||
|
0,25 мМ |
0,1(0,1;0,1)0,313 |
0,2(0,2;0,2)0,038 |
0,3(0,3;0,3)0,038 |
4,0(4,0;4,0)0,213 |
|
0,5 мМ |
0,1(0,1;0,1)0,313 |
0,2(0,2;0,2)0,009 |
0,5(0,4;0,5)0,001 |
4,1(4,0;4,2)0,080 |
|
1 мМ |
0,1(0,1;0,1)0,072 |
0,3(0,2;0,2)0,004 |
0,6(0,6;0,7)0,002 |
4,0(3,9;4,0)0,320 |
|
2 мМ |
0,1(0,1;0,2)0,021 |
0,3(0,3;0,3)0,003 |
0,8(0,7;0,8)0,001 |
3,9(3,8;3,9)0,419 |
|
4 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,001 |
0,4(0,4;0,4)0,002 |
1,0(1,0;1,0)0,001 |
3,4(3,3;3,5)0,054 |
|
Аскорбиновая кислота |
||||
|
0,25 мМ |
0,1(0,1;0,1)0,040 |
0,2(0,1;0,2)0,118 |
0,2(0,2;0,3)0,375 |
4,2(4,2;4,2)0,009 |
|
0,5 мМ |
0,1(0,1;0,1)0,072 |
0,2(0,2;0,2)0,009 |
0,3(0,3;0,3)0,038 |
4,1(4,1;4,2)0,035 |
|
1 мМ |
0,1(0,1;0,1)0,072 |
0,2(0,2;0,2)0,038 |
0,3(0,3;0,3)0,008 |
4,0(4,0;4,1)0,035 |
|
2 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,004 |
0,2(0,2;0,2)0,007 |
0,4(0,4;0,4)0,001 |
4,0(3,9;4,0)0,237 |
|
4 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,001 |
0,3(0,3;0,3)0,002 |
0,5(0,5;0,6)0,002 |
3,7(3,7;3,7)0,387 |
|
N-ацетилцистеин |
||||
|
0,25 мМ |
0,1(0,1;0,1)0,072 |
0,1(0,1;0,2)0,294 |
0,2(0,2;0,2)0,813 |
4,2(4,1;4,2)0,017 |
|
0,5 мМ |
0,1(0,1;0,2)0,021 |
0,2(0,2;0,2)0,038 |
0,3(0,3;0,3)0,008 |
4,1(4,1;4,2)0,039 |
|
1 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,004 |
0,2(0,2;0,2)0,009 |
0,3(0,3;0,3)0,008 |
4,2(4,2;4,2)0,013 |
|
2 мМ |
0,1(0,1;0,2)0,021 |
0,2(0,2;0,2)0,009 |
0,4(0,4;0,4)0,002 |
3,9(3,9;4,0)0,351 |
|
4 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,001 |
0,3(0,3;0,3)0,003 |
0,6(0,5;0,6)0,001 |
3,7(3,7;3,7)0,561 |
|
Метилэтилпиридинол |
||||
|
0,25 мМ |
0,1(0,0;0,1)0,313 |
0,2(0,1;0,2)0,118 |
0,3(0,2;0,3)0,138 |
4,1(4,1;4,1)0,085 |
|
0,5 мМ |
0,1(0,1;0,1)0,040 |
0,2(0,2;0,2)0,009 |
0,3(0,3;0,3)0,006 |
4,1(4,0;4,1)0,115 |
|
1 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,001 |
0,2(0,2;0,3)0,005 |
0,5(0,4;0,5)0,001 |
4,0(4,0;4,1)0,150 |
|
2 мМ |
0,2(0,2;0,2)0,001 |
0,4(0,4;0,5)0,002 |
1,0(1,0;1,1)0,001 |
3,7(3,6;3,7)0,561 |
|
4 мМ |
0,3(0,3;0,3)0,002 |
1,1(1,1;1,3)0,002 |
3,1(3,1;3,3)0,001 |
3,5(3,5;3,5)0,072 |
Особый интерес представляет собой взаимодействие метилэтилпиридинола и гентамицина. Оба вещества обладают антибактериальными свойствами, но антиоксидант уменьшает активность антибиотика. Поэтому логичным является предположение, что метилэтилпиридинол и гентамицин являются конкурентными антагонистами, и, возможно, подавляют развитие бактерий за счет угнетения синтеза белка на уровне 30S-субъединицы рибосомы. Поскольку метилэтилпиридинол оказывает значительно более слабое действие, а его молярная концентрация превышает таковую для антибиотика, гентамицин не реализует антибактериальный эффект в полной мере.
Общим механизмом снижения чувствительности к гентамицину под влиянием антиоксидантов может быть изменение окислительно-восстановительного потенциала бактериальной трансляционной машины, обеспечивающей синтез белка и являющейся первичной мишенью действия гентамицина. В подтверждение имеются некоторые исследования, демонстрирующие изменение синтеза белка под действием веществ, влияющих на процессы свободнорадикального окисления [9]. Кроме того, антиоксиданты могут нейтрализовать токсические активные формы кислорода, образующиеся в результате неправильной упаковки белков и активации бактериальных ферментных систем Cpx и Arc [8].
Выводы
Установлено, что восстановленный глутатион в концентрациях 0,25–0,5 мМ стимулирует развитие бактерий, в концентрациях 2 и 4 мМ оказывает угнетающее действие. Аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин и метилэтилпиридинол оказывают слабое антибактериальное действие, причем сила эффекта напрямую зависит от концентрации антиоксиданта. Все изучаемые антиоксиданты вызывают снижение чувствительности изучаемого штамма к гентамицину. Особенно сильно активность гентамицина снижает метилэтилпиридинол. Полученные данные необходимо учитывать при использовании гентамицина при инфекции, вызванной Escherichia coli.
Рецензенты:
Смирнов И.В., д.м.н., зав. кафедрой фармакогнозии и ботаники, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул;
Карбышева Н.В., д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул.
Работа поступила в редакцию 11.04.2013.
Библиографическая ссылка
Мирошниченко А.Г., Брюханов В.М., Бутакова Л.Ю., Госсен И.Е., Перфильев В.Ю., Смирнов П.В. ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ НА РАЗВИТИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ ESCHERICHIA COLI И ЕЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ГЕНТАМИЦИНУ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 5-2. – С. 339-343;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=31616 (дата обращения: 19.04.2024).