Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

Использование методов молекулярно-генетического анализа для изучения полиморфизма ДНК растений рода RHODODENDRON с целью их паспортизации

Калаев В.Н. 2 Землянухина О.А. 1 Карпеченко И.Ю. 1 Карпеченко К.А. 1 Кондратьева А.М. 1 Вепринцев В.Н. 2 Карпеченко Н.А. 2 Карпова С.С. 2 Моисеева Е.В. 2 Баранова Т.В. 2
1 Научно-исследовательский институт лесной генетики и селекции, Воронеж
2 Воронежский государственный университет, Воронеж
В статье приведены результаты исследования по использованию молекулярно-генетического анализа на основе ПЦР с использованием шести RAPD-праймеров. Исследование проводилось на 8 видах представителей рода Rhododendron L. с целью выявления индивидуальных спектров ампликонов и дальнейшей паспортизации. Число амплифицированных фрагментов ДНК варьировалось в зависимости от праймера от 16 (праймер Oligo 2) до 18 (праймер Oligo 4, Oligo 6, Oligo 1), а их размеры – от 170 до 2800 п.н. В среднем, при RAPD-анализе у видов рода рододендрон один праймер инициировал синтез 18,16 фрагмента ДНК. Общее количество локусов амплификации для каждого праймера по 8 видам составило 104. На основе полученных данных было определено процентное сходство в структуре ДНК представителей разных видов. Показано, что данный вид ПЦР анализа является весьма информативным при паспортизации рододендронов, но, безусловно, результаты данной работы необходимо подкреплять другими видами молекулярно-генетических исследований.
ДНК
ампликон
праймер
рододендрон
молекулярно-генетический анализ
ПЦР
1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. – М.: Мир, 1994. – Т. 1. – С. 520.
2. Баранов О.Ю., Каган Д.И. Микросателлитный анализ берёзы повислой // Молекулярная и прикладная генетика. – 2005. – Т. 1. – С. 157.
3. Боронникова С.В., Кокаева З.Г., Гостимский С.А., Дрибноходова О.П., Тихомирова Н.Н. // Генетика. – 2007. – Т.43, №5. – С. 653–659.
4. Ковалевич О.А., Каган Д.И. Изменчивость митохондриальной ДНК дуба черешчатого на территории Белоруссии // Наука о лесе XXI века: материалы международной научно-практической конференции. – Гомель, 2010. –
С. 192–195.
5. Кондратович Р.Я. Рододендроны. – Рига: Авотс, 1981. – 231 с.
6. Стегний В.Н., Чудинова Ю.В., Салина Е.А. RAPD-анализ разнопродуктивных сортов и гибридов льна культурного // Генетика. – 2000. – Т. 36, № 10. – С. 1370–1373.
7. Созинова Л.Ф., Цветков И.Л., Комаров А.Б. Разработка протокола генетической дифференциации сортов пшеницы с использованием нового класса молекулярно-генетических маркеров // Биотехнология. Теория и прак-
тика. – 2007. – № 3. – С. 24–31.
8. Цветков И.А., Иванов А.Н., Глазко В.И. Генетическая дифференциация сортов риса по IRAP-маркерам // Известия ТСХА. – 2006. – № 4. – С. 155–159.
9. Chalmer K.J., Waugh R., Sprent J.I., Simons A.J., Powell W. Detection of genetic variation between and within populations of Gliricidia sepium and G. maculata using RAPD markers // Heredity. – 1992. – Vol. 69. – P. 465–172.
10. Lanying Zh., Yongqing W., Li Zh. Genetic diversity and relationship of Rhododendron species based on RAPD analysis // American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci. – 2008. – Vol. 3 (4). – P. 626–631.
11. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski, J.A.
and Tingey. S.V. // Nucl. Acids Res. – 1990. – Vol. 18. – P. 6531–6535.

Род рододендрон (Rhododendron L.) семейства Вересковые (Ericaceae) насчитывает около тысячи видов вечнозеленых, полулистопадных и листопадных кустарников и деревьев. Кроме того, среди чистых видов встречается большое количество естественных гибридов, а селекционерами создаются гибриды и сорта, несущие признаки, характерные для различных видов. Это создает определенные трудности для определения видовой принадлежности и систематического положения представителей данного рода [5, 10]. В настоящее время в систематике для определения видов наряду с морфологическими и анатомическими признаками используются и данные биохимических и генетических исследований, хотя доля последних все еще несоизмеримо мала [10]. Неоспоримая ценность такого подхода обусловлена требованиями современной науки к разработке естественной классификации, отражающей не только формовое разнообразие, но и эволюционно-таксономические взаимоотношения видов внутри рода Rhododendron.

Генетическая паспортизация представляет собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью морфологических или молекулярных маркеров. Описание морфологических характеристик селекционного материала - элемент классического генетического анализа и селекционного скрининга, его можно считать первым этапом генетической паспортизации [4]. Второй этап связан с разработкой и использованием биохимических и молекулярно-генетических маркеров.

На сегодняшний день проведение генетической паспортизации считается актуальной задачей современной селекции. В мировой практике для паспортизации пород и индивидуальной паспортизации объектов лесного и сельского хозяйства используют преимущественно ДНК-маркеры. Это ядерные элементы, в основном микросателлиты, так называемые STR-маркеры или последовательности ДНК, ограниченные инвертированными повторами.

Молекулярно-генетический анализ имеет ряд существенных преимуществ перед морфофизиологическим. Применение данного метода является актуальным для:

1) оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений, с учетом показателей генетического разнообразия, установленных по результатам молекулярного маркирования множественных геномных участков, а также с обязательным учетом уровней внутри- и межпопуляционного разнообразия;

2) сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений с возможностью проведения отбора в природных условиях популяций и их групп как с наиболее типичными, так и со специфичными характеристиками генофондов;

3) молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация генофондов редких и исчезающих видов растений необходима для оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне, позволяющая на основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК составить молекулярно-генетическую формулу, штрих-код популяций и обобщить данные в виде генетического паспорта [4].

Среди молекулярных маркеров, имеющих множественную локализацию в геноме, наиболее распространёнными являются RAPD-маркеры (RAPD-ПЦР - случайно амплифицированная полиморфная ДНК). Методика ПЦР позволяет амплифицировать ДНК из любой части генома, в том числе фрагменты ДНК с неизвестной (анонимной) нуклеотидной последовательностью [11].

Цель исследования. В рамках комплексного подхода к решению проблемы систематизации представителей рода Rhododendron начата работа, целью которой стало молекулярно-генетическое маркирование с использованием RAPD-метода коллекции рододендронов Ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского государственного университета.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили свежие листья 8 видов растений рода рододендрон: Rh. smirnovii, Rh. catawbiense, Rh. brachycarpum, Rh. quinquefolium, Rh. albrechtii, Rh. japonicum,
Rh. dauricum, Rh. thomsonii.

Начальным этапом данного исследования явилось получение препаратов нуклеиновых кислот (ДНК). Как оказалось, при выделении ДНК из разных объектов необходимо учитывать их физиологические и биохимические особенности и, в соответствии с полученными данными, адаптировать уже известные методы выделения ДНК путем внесения в них необходимых модификаций.

Выделение ДНК проводили по модифицированной методике с использованием в качестве детергента ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид). Качество и количество полученных препаратов определяли спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-102, а также при помощи электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Реакцию ПЦР проводили с использованием RAPD-праймеров (декануклеотидные праймеры к инвертированным повторам) в амплификаторе «Терцик» в течение 2 часов. Для ПЦР была использована реакционная смесь следующего состава: 2,5 мкл 10*ПЦР буфера (100 мМ Трис-НCl; рН 8,8; 500 мМ КСl), 25 мМ MgCl2, смесь 10 мМ нуклеотидтрифосфатов, 10 мМ праймера, 1 ед. Taq ДНК-полимераза и 1 мкл ДНК (20 нг/мкл).

Для ПЦР применялись следующие RAPD-праймеры: Oligo 1, Oligo 2, Oligo 4, Oligo 6, Oligo 12 и Oligo 29. Температуру отжига для каждого из праймеров подбирали в компьютерной программе OLIGO 6. На следующем этапе выполняли электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 2% агарозном геле с 1х ТАЕ-буфером при 120 Вт в течение 2 ч, длина пробега 5-7 см. Готовый гель окрашивали бромистым этидием, фрагменты ДНК анализировали в трансиллюминаторе Vilber Lourmat. Размеры полученных ампликонов определяли с использованием программного обеспечения Gel Imager-2.

Результаты исследования и их обсуждение

Для выявления индивидуальных различий в структуре ДНК и составления их генетических паспортов для каждого вида рододендронов была проведена ПЦР с каждым из 6 RAPD-праймеров, которые фланкировали участки ДНК, ограниченные инвертированными повторами. На основании полученных спектров ампликонов были составлены таблицы, отражающие наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для каждого из праймеров (наличие ампликона обозначалось цифрой 1, отсутствие цифрой 0) (табл. 1-6).

Таблица 1

Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного
для праймера Oligo 2, у восьми видов рододендронов

Ампликон п.н.

 

Вид

1930

1630

1470

1050

880

770

690

625

590

500

430

390

370

280

220

200

Rh. smirnovii

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

1

0

0

1

0

Rh. catawbiense

1

0

0

1

1

0

0

0

0

1

1

0

0

1

1

0

Rh. brachycarpum

1

1

1

1

1

0

0

1

0

1

0

0

0

0

0

0

Rh. quinquefolium

0

0

1

1

1

1

0

0

1

0

0

0

0

1

0

0

Rh. japonicum

0

0

1

1

0

0

1

0

1

1

0

1

0

0

0

1

Rh. albrechtii

0

0

1

1

0

0

0

1

0

0

0

1

0

1

0

0

Rh. dauricum

0

0

1

0

1

1

0

1

1

0

1

1

1

0

1

1

Rh. thomsonii

0

0

1

1

1

1

1

1

1

1

0

1

0

0

0

1

 

Таблица 2

Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 12 праймера, у шести видов рододендронов

Ампликон п.н.

 

Вид

2800

1400

1230

1070

925

800

730

690

600

500

470

360

330

300

280

240

210

Rh. smirnovii

0

0

1

0

0

0

0

0

0

1

0

1

0

1

0

0

0

Rh. atawbiense

0

0

0

1

0

0

1

1

0

1

0

1

0

1

1

0

1

Rh. brachycarpumный

0

0

0

0

1

1

0

1

0

1

0

1

0

1

1

0

1

Rh. quinquefolium

0

0

0

1

0

1

0

1

0

1

1

0

0

0

0

0

0

Rh. japonicum

1

1

0

0

0

0

1

1

0

1

1

1

0

0

1

0

1

Rh. albrechtii

0

0

0

0

1

0

0

1

0

0

1

1

1

1

0

0

0

Rh. dauricum

0

0

1

0

1

0

0

1

1

1

0

1

0

0

0

1

0

Rh. thomsonii

0

0

0

0

0

0

1

0

1

1

0

1

0

0

0

0

0

 

Таблица 3

Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 6 праймера, у восьми видов рододендронов

Ампликон п.н.

 

Вид

1620

1190

1060

920

800

700

600

550

510

450

410

380

320

280

240

220

130

170

Rh. smirnovii

0

1

1

0

0

0

0

1

0

0

0

1

1

0

0

1

0

1

Rh. catawbiense

0

1

0

0

1

1

0

0

0

1

0

1

1

1

0

0

0

1

Rh. brachycarpumй

0

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

1

1

1

1

0

0

1

Rh. quinquefolium

1

1

0

0

0

0

1

0

0

0

1

1

1

0

1

0

0

0

Rh. japonicum

0

1

0

0

0

1

1

0

1

1

1

0

1

0

1

0

0

0

Rh. albrechtii

0

1

0

0

1

1

1

0

0

0

0

1

1

0

0

1

0

0

Rh. dauricum

1

1

1

0

1

0

1

0

1

0

1

1

0

0

0

0

1

0

Rh. thomsonii

1

0

1

0

0

0

0

1

1

0

1

1

0

1

1

0

0

0

 

Таблица 4

Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 4 праймера, у восьми видов рододендронов

Ампликон п.н.

 

Вид

2000

1640

1400

1160

1000

900

800

700

650

600

535

480

420

390

340

300

250

200

Rh. smirnovii

0

0

0

0

0

1

1

0

1

1

1

0

0

0

0

1

0

1

Rh. catawbiense

0

0

1

1

1

1

0

0

0

1

1

0

1

1

0

1

0

0

Rh brachycarpum

0

0

1

1

0

1

0

1

0

0

0

0

1

0

1

1

0

0

Rh quinquefolium

0

1

1

1

0

0

0

0

1

1

1

0

0

0

0

0

0

0

Rh. japonicum

0

0

0

0

0

0

1

0

0

1

1

1

1

1

0

0

0

0

Rh. albrechtii

0

0

0

1

1

0

1

0

0

1

0

1

0

0

1

0

0

0

Rh. dauricum

0

0

1

1

0

0

0

1

0

0

1

1

1

0

1

0

1

0

Rh. thomsonii

1

0

1

1

0

0

0

1

0

1

1

0

1

1

1

0

0

0

Таблица 5

Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 1 праймера, у восьми видов рододендронов

Ампликон п.н.

 

Вид

2000

1800

1580

1370

1200

1000

930

870

690

610

560

500

445

380

300

260

240

210

Rh. smirnovii

0

1

1

1

0

0

0

0

0

0

0

1

0

1

0

0

1

0

Rh. catawbiense

0

1

1

1

1

0

0

0

1

0

1

0

1

0

0

0

0

1

Rh. brachycarpumный

0

1

0

0

1

1

0

0

0

1

0

0

1

0

1

0

0

1

Rh. quinquefolium

1

0

1

0

0

0

1

1

0

1

0

0

0

1

0

1

1

0

Rh. japonicum

1

0

1

1

0

1

0

0

1

0

1

1

0

1

0

0

0

0

Rh. albrechtii

0

0

1

0

1

0

1

0

1

0

0

1

1

0

1

0

0

0

Rh. dauricum

0

0

1

0

0

0

1

0

1

1

1

0

1

1

0

1

0

0

Rh. thomsonii

0

0

1

0

0

0

0

0

1

0

1

0

1

1

0

1

0

0

Таблица 6

Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 29 праймера, у восьми видов рододендронов.

Ампликон п.н.

 

Вид

2400

1850

1640

1330

1150

970

830

650

600

560

530

500

470

415

380

300

240

Rh. smirnovii

0

1

0

0

0

1

0

0

1

0

1

1

0

0

0

0

0

Rh. catawbiense

0

0

0

1

0

0

0

0

1

1

0

1

0

1

0

0

1

Rh. brachycarpumный

1

0

1

0

1

1

0

0

1

1

0

1

0

0

0

0

1

Rh. quinquefolium

0

0

1

0

1

0

0

1

0

0

0

1

0

1

0

0

0

Rh. japonicum

0

0

1

0

1

0

1

1

1

0

0

1

1

1

0

0

0

Rh. albrechtii

0

0

0

1

1

0

0

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

Rh. dauricum

0

0

0

1

0

1

1

0

0

0

0

1

0

0

0

1

0

Rh. thomsonii

0

0

0

1

0

1

0

1

0

0

1

1

0

0

0

1

0

Из анализа представленных в таблицах данных можно сделать заключение о том, что использованные в работе RAPD-праймеры (Oligo 1, Oligo 2, Oligo 4, Oligo 6, Oligo 12, Oligo 29) позволили получить для каждого образца спектр ампликонов и показали высокую информативность и стабильность. Число амплифицированных фрагментов ДНК варьировалось в зависимости от праймера от 16 (праймер Oligo 2) до 18 (праймер Oligo 4, Oligo 6, Oligo 1), а их размеры - от 170 до 2800 п.н. В среднем при RAPD-анализе у рододендрона один праймер инициировал синтез 18,16 фрагмента ДНК. Общее количество локусов амплификации для каждого праймера по 8 видам составило 104.

Последующий анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что генотипы 8 изученных видов рододендронов, несмотря на сходство между собой, имеют ряд индивидуальных отличий. Идентичность генотипов составила от 23,53% (Rh. smirnovii и Rh. dauricum) до 88,9% (Rh. dauricum и Rh. thomsonii).

Полученные усреднённые данные по сходству последовательностей ДНК (в%) для каждого вида приведены в табл. 7. Из анализа указанной таблицы следует, что наибольшее сходство в структуре ДНК имеют виды Rh. thomsonii и Rh. dauricum, последовательность их ДНК схожа на 74,31%. Наименьшее сходство в последовательности ДНК имеют виды Rh. smirnovii и Rh. dauricum, Rh. brachycarpum и Rh. dauricum. Их ДНК схожа на 48,62%. Внутривидовые различия структуры ДНК у 8 видов рододендрона составили в среднем 6,3%, что говорит о том, что каждая из изученных выборок рододендронов действительно состояла из образцов одного вида.

Таблица 7

Сходство последовательностей ДНК (среднее по 6 праймерам) у изученных видов рододендронов

 

Rh. smirnovii

 

 

 

 

 

 

 

Rh. smirnovii

100

Rh. catawbiense

 

 

 

 

 

 

Rh. catawbiense

63,30

100

Rh. brachycarpum

 

 

 

 

 

Rh. brachycarpum

54,18

67,89

100

Rh. quinquefolium

 

 

 

 

Rh. quinquefolium

56,88

53,21

54,13

100

Rh. japonicum

 

 

 

Rh. japonicum

56,88

57,8

49,54

62,39

100

Rh. albrechtii

 

 

Rh. albrechtii

56,88

60,55

57,8

59,63

60,55

100

Rh. dauricum

 

Rh. dauricum

48,62

49,54

48,62

59,63

51,38

57,8

100

Rh. thomsonii

Rh. thomsonii

57,8

52,29

52,29

61,48

60,55

54,13

74,31

100

Таким образом, применение шести RAPD-праймеров позволило нам обнаружить различия в структуре ДНК рододендронов разных видов, что дает возможность для составления индивидуальных генетических паспортов с целью их систематизации.

Заключение

В результате проведенного исследования с использованием в полимеразной цепной реакции RAPD-праймеров Oligo 1, Oligo 2, Oligo 4, Oligo 6, Oligo 12, Oligo 29 в спектрах ампликонов у 8 видов рододендронов выявили индивидуальные различия, связанные с присутствием/отсутствием отдельных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами терминальных участков ретротранспозонов. Эти различия свидетельствуют о сложности процессов возникновения генетической изменчивости.

Таким образом, на большом фактическом материале убедительно доказано, что для оценки генетического разнообразия и паспортизации видов рододендронов подходящим является использование ДНК-анализа на основе ПЦР с использованием RAPD-праймеров. Однако для более полной молекулярно-генетической характеристики необходимо применение комплексного подхода, включающего и другие методы на основе ПЦР, позволяющие получить достоверную и объективную информацию для целей идентификации и сохранения генетического материала коллекции рододендронов ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского государственного университета.

Данная работа выполнена в рамках и при поддержке государственного контракта на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ федеральной целевой программы Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы № 16.518.11.7099 Оценка состояния растительных ресурсов при интродукции в Центрально-Черноземном регионе и разработка мероприятий по их сохранению на базе ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета

Рецензенты:

  • Дурнова Н.А., д.б.н., доцент, зав. кафедрой общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Саратов;
  • Полуконова Н.В., д.б.н., профессор кафедры общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Саратов.

Работа поступила в редакцию 06.04.2012.


Библиографическая ссылка

Калаев В.Н., Землянухина О.А., Карпеченко И.Ю., Карпеченко К.А., Кондратьева А.М., Вепринцев В.Н., Карпеченко Н.А., Карпова С.С., Моисеева Е.В., Баранова Т.В. Использование методов молекулярно-генетического анализа для изучения полиморфизма ДНК растений рода RHODODENDRON с целью их паспортизации // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 6-2. – С. 323-328;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29984 (дата обращения: 29.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674