Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Бебякова Н.А. 1 Левицкий С.Н. 1 Шабалина И.А. 1

---

1 Северный государственный медицинский университет, Архангельск

Введение даларгина (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) и его стабилизированного аналога (Tyr-D-Ala-Gly-МеPhe-Leu-Arg) в дозах 10 и 100 мкг/кг сопровождалось снижением стрессобусловленного тонуса сосудов. Вероятным механизмом такого эффекта пептидов в данных дозах является увеличение секреции NO. При этом уровень NO на фоне стимуляции опиатных рецепторов пептидами в дозе 100 мкг/кг не отличался, а в дозе 10 мкг/кг наблюдался выраженный роcт NO на фоне введения стабилизированного аналога. Введение пептидов в дозе 1000 мкг/кг сопровождалось увеличением тонуса сосудов в условиях стресса. При этом на фоне введения даларгина зарегистрировано снижение NO и увеличение содержания ЭТ-1 в плазме крови, в то время как введение аналога, наоборот, сопровождалось ростом уровня NO к концу иммобилизации, что могло быть следствием стабилизации молекулы даларгина.

Статья в формате PDF

333 KB

иммобилизация

тонус сосудов

опиоидные пептиды

опиатные рецепторы

даларгин

аналоги даларгина

1. Гемодинамические реакции острого стресса на фоне введения даларгина / Н.А. Бебякова, А.В. Хромова, Т.М. Командресова, С.Н. Курицын // Вестник Поморского университета: Сер. Физиологические и психолого-педагогические науки. – 2006. – №2. – С. 18–24.

2. Роль опиоидергической системы в модуляции периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса / Н.А. Бебякова, Т.М. Командресова, С.Н. Курицын, А.В. Хромова, Ж.Д. Беспалова // Клиническая физиология кровообращения. – 2006. – №3. – С. 45–49.

3. Бебякова Н.А. Методика оценки функционального состояния сердечно-сосудистой системы мелких лабораторных животных с помощью диагностического компьютерного комплекса «Диастом-01» / Н.А. Бебякова, С.Д. Михайлова, А.В. Хромова // Патол. физиология и эксперим. терапия. – 2002. – №1. – С. 25.

4. Лишманов Ю.Б. Опиатергическая регуляция состояния центральной гемодинамики / Ю.Б. Лишманов, Л.Н. Маслов // Пат. физиология и эксперимент. терапия. – 2003. – №1. – С. 2–11.

5. Антиангинальный и антиатерогенный эффект D-Ala2-Leu5-Arg6-энкефалина (даларгина) / Л.Н. Маслов, Н.А. Фёдорова, В.А. Дудко и др. // Клин. фармакология и терапия. – 2003. – №4. – С. 80–83.

6. Кардиоваскулярные эффекты D-Ala2, Leu5, Arg6-энкефалина (даларгин) связаны с активацией периферических опиоидных μ-рецепторов / Л.Н. Маслов, Ю.Б. Лишманов, Е.И. Базарх и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2008. – №2. – С. 21–28.

7. Изучение деградации даларгина и его аналогов в мембранах щёточной каймы энтероцитов крысы методом Н-ЯМР спектроскопии / Н.Ф. Сепетов, О.Л. Исакова, Б.Л. Пекелис и др. // Бюллетень ВКНЦ АМН СССР. – 1986. – №2 – С. 86–89.

8. Судаков К.В. Олигопептиды в механизмах устойчивости к эмоциональному стрессу // Патол. физиология и эксперим. терапия. – 1989. – №1. – С. 3–11.

9. Титов М.И. Даларгин-пептидный препарат с цитопротективным действием / М.И. Титов, В.А. Виноградов, Ж.Д. Беспалова // Бюллетень ВКНЦ. – 1985. – №2. – С. 72–76.

10. Унгуряну Т.Н. Краткие рекомендации по описанию, статистическому анализу и представлению данных в научных публикациях / Т.Н. Унгуряну, А.М. Гржибовский // Экология человека. – 2011. – №5. – С. 55–60.

Проявление стрессобусловленных изменений в деятельности функциональных систем организма ограничивается рядом стресс-лимитирующих систем, одной из которых является опиоидергическая система. Экспериментальные исследования свидетельствуют, что синтетические аналоги опиоидных пептидов обладают кардиоваскулярной активностью [6] и в том числе способны корректировать стрессобусловленные изменения сосудистого тонуса [1]. Вероятным механизмом такого действия может быть изменение уровня эндотелиальных вазоактивных факторов - оксида азота (NO) и эндотелина-1 (ЭТ-1) на фоне активации опиатных рецепторов [2, 5].

Первым синтетическим аналогом эндогенных опиоидных пептидов, разрешённым к клиническому применению, является даларгиин - аналог лей-энкефалина, неселективный агонист µ- и δ-опиатных рецепторов (ОР). Однако, согласно исследованиям, в сыворотке крови человека даларгин подвергается быстрой деградации с образованием более стабильных пента- и тетрапептидов, поэтому был создан ряд структурных аналогов, за счёт модификации молекулы даларгина, с целью придания ей большей устойчивости к деградации [7].

Цель исследования - изучить влияние неселективного агониста µ- и δ-ОР даларгина и его стабилизированного аналога на механизмы эндотелиальной коррекции стрессобусловленного сосудистого тонуса.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили половозрелые бодрствующие самцы крыс популяции Wistar. Острый стресс моделировали путём иммобилизации животных в камере без жёсткой фиксации в течение часа [8]. Тонус сосудов измеряли методом тетраполярной реовазографии с помощью многофункционального компьютерного диагностического комплекса «Диастом-01». Запись реовазограмм хвостовой артерии крысы проводили на 5-й, 15-й, 30-й, 45-й, 60-й мин эксперимента, что позволило в динамике проследить стрессобусловленные изменения сосудистого тонуса. Функциональное состояние периферических сосудов оценивали с использованием количественных показателей: индекса периферического сопротивления (ИПС), индекса эластичности (ИЭ) [3].

Исследование включало 8 серий экспериментов по 15 особей в каждой серии. Группа интактных животных не подвергалась каким-либо воздействиям. Контрольной группе животных внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в объёме 0,9 мл. Животным экспериментальных групп вводили даларгин (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) и его стабилизированный аналог (Tyr-D-Ala-Gly-МеPhe-Leu-Arg), модификация которого проведена за счёт N-метилирования фенилаланинового остатка. Пептиды вводили внутрибрюшинно в объёме 0,9 мл физиологического раствора в дозах, не проникающих через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) (10 и 100 мкг/кг) и проникающих через ГЭБ (1000 мкг/кг) [9]. Даларгин и его стабилизированный аналог синтезированы в лаборатории синтеза пептидов РКНП МЗ РФ (рук. канд. хим. наук Беспалова Ж.Д.).

Для измерения концентрации NO, ЭТ-1, кортикостерона в плазме крови, стабилизированной ЭДТА, использовали наборы для количественного определения окиси азота (R&D systems), эндотелина (1-21) (Biomedica), кортикостерона (Assay Designs) в биологических жидкостях.

Полученные количественные данные описывали с помощью медианы и процентилей: Ме (P25-75). Оценку статистических различий внутри групп проводили с использованием критерия Фридмана, между группами с помощью критерия Краскела-Уоллиса, с последующими апостериорными сравнениями с использованием критериев Вилкоксона и Манна-Уитни соответственно. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 [10].

Результаты исследования и их обсуждение

На модели часовой иммобилизации выявлена активация гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, которая проявлялась в повышении содержания кортикостерона в плазме крови контрольных животных на 129,9 % (р = 0,002) по сравнению с интактными животными. В данных условиях наблюдался стрессобусловленный рост периферического тонуса сосудов и снижение их эластичности. Так, ИПС к 60-й мин эксперимента возрастал на 82,8 % (р = 0,001), а ИЭ снижался на 49,1 % (р = 0,001) по сравнению с 5-й мин иммобилизации (рис. 1, 2).

Рис. 1. Стрессобусловленные изменения ИПС
на фоне введения опиоидных пептидов в разных дозах

Рис. 2. Стрессобусловленные изменения ИЭ на фоне введения опиоидных пептидов в разных дозах

Изменялся уровень вазоактивных эндотелиальных факторов: происходило некоторое снижение уровня NO на 13,1 % и увеличение ЭТ-1 на 8,5 % по сравнению с фоновыми показателями (рис. 3, 4).

Активация ОР оказывала протективный эффект на стрессобусловленный сосудистый тонус. При введении даларгина в дозе 10 мкг/кг снижение стрессобусловленного роста сосудистого тонуса наблюдалось с 15 мин эксперимента. ИПС на 15-й мин стрессирования был ниже контрольного значения на 23,1 % (p = 0,001). Такое значение показателя стабильно сдерживалось до 45-й мин и лишь к концу эксперимента вновь возрастало, хотя и оставалось ниже контрольного значения на 13,5 % (p = 0,001). ИЭ, снижаясь к концу иммобилизации, остался выше контрольного значения на 51,9 % (p = 0,000). На фоне введения даларгина в дозе 100 мкг/кг уже с 5-й мин иммобилизации наблюдалось выраженное снижение ИПС по сравнению с контролем на 22,8 % (p = 0,000). В условиях иммобилизации наблюдался постепенный рост ИПС, но к 60-й мин стрессирования он остался ниже контрольного уровня на 18,3 % (p = 0,02) (рис. 3). ИЭ был выше контрольного значения с 5-й мин на 10,9 % (p = 0,04), а к 60-й мин - на 33,7 % (p = 0,000) (см. рис. 1, 2).

Рис. 3. Изменения уровня NO на фоне введения
опиоидных пептидов в разных дозах:
1 - фон; 2 - стресс; 3 - даларгин 10 мкг/кг;
4 - даларгин 100 мкг/кг;
5 - даларгин 1000 мкг/кг; 6 - аналог 10 мкг/кг;
7 - аналог 100 мкг/кг; 8 - аналог 1000 мкг/кг

Рис. 4. Изменения уровня ЭТ-1 на фоне введения
опиоидных пептидов в разных дозах:
1 - фон; 2 - стресс; 3 - даларгин 10 мкг/кг;
4 - даларгин 100 мкг/кг;
5 - даларгин 1000 мкг/кг; 6 - аналог 10 мкг/кг;
7 - аналог 100 мкг/кг; 8 - аналог 1000 мкг/кг

Анализ уровня эндотелиальных факторов показал, что при введении даларгина в дозе 100 мкг/кг происходило заметное увеличение NO к концу иммобилизации на 73,7 % (p = 0,003) по сравнению с фоновым уровнем и на 100,0 % (p = 0,002) по сравнению со стрессовым значением этого показателя (см. рис. 3). Содержание ЭТ-1 при этом заметно не изменилось (см. рис. 4). Кроме того, на фоне введения даларгина в данной дозе наблюдалась тенденция к снижению уровня кортикостерона на 9,0 % по отношению к стрессовому показателю. Снижение тонуса сосудов в ответ на введение даларгина выявили и другие исследователи. Такое действие пептида связывают с активацией NO-синтазы в эндотелии сосудов [5]. При введении пептида в дозе 10 мкг/кг заметных изменений в содержании NO и ЭТ-1 к концу стрессирования не выявлено. Однако в данной дозе пептид всё же сдерживал рост тонуса сосудов в условиях стресса. Вероятно, низкая стабильность даларгина и малая доза действующего вещества привели к активации небольшого количества опиатных рецепторов. Такая непродолжительная активация смогла запустить эндотелиальные механизмы, способствовавшие снижению тонуса сосудов в условиях стресса.

Активация периферических ОР аналогом даларгина сопровождалась снижением стрессобусловленного сосудистого тонуса на протяжении всего эксперимента. При введении аналога в дозах 10 и 100 мкг/кг ИПС уже с 5-й мин был ниже контрольного на 17,8 % (p = 0,005) и 22,9 % (p = 0,000), а на 60-й мин - на 11,2 % (p = 0,000) и 8,2 % (p = 0,001) соответственно (см. рис. 1). ИЭ в этих условиях к концу иммобилизации остался выше стрессового уровня на 23,6 % (p = 0,029) и 18,6 % (p = 0,019) соответственно (см. рис. 2). На фоне введения аналога в дозе 100 мкг/кг наблюдали снижение кортикостерона на 18,1 % (р = 0,041).

Введение аналога даларгина сопровождалось увеличением уровня NO. Так, активация ОР пептидом в дозе 10 мкг/кг приводила к росту уровня NO как по сравнению с фоновым показателем на 53 % (p = 0,000), так и со стрессовым значением этого показателя на 76,0 % (p = 0,000). Введение аналога в дозе 100 мкг/кг также сопровождалось увеличением NO на 75,3 % (p = 0,000) по сравнению с фоновыми значениями и на 101,7 % (p = 0,000) со стрессовым уровнем (см. рис. 3). Изменения активности эндотелиновой системы в данных условиях не наблюдалось (см. рис. 4). Следовательно, снижение стрессобусловленного тонуса сосудов на фоне введения аналога даларгина в данных дозах могло быть связано с увеличением уровня вазодилататора NO. Таким образом, использование стабилизированного аналога даларгина позволило подтвердить предположение о том, что протективный эффект активации µ- и δ-ОР в дозе 10 мкг/кг также связан с активацией синтеза NO.

Введение даларгина и его стабилизированного аналога в дозе 1000 мкг/кг сопровождалось провокационным эффектом на тонус сосудов в условиях стресса (см. рис. 1, 2). Такой эффект известен для регуляторных пептидов, когда при превышении оптимальной дозы происходит уменьшение терапевтического эффекта пептида, вплоть до его исчезновения [9]. При введении даларгина на фоне острого стресса уровень NO оказался ниже фонового и стрессового значений на 24,0 % (p = 0,003) и на 12,8 % (p = 0,02) соответственно, а концентрация ЭТ-1, наоборот, выше фонового на 18,4 % (р = 0,036) и несколько выше стрессового уровня (на 7,3 %) (см. рис. 3, 4). Следовательно, в данных условиях увеличение вазоконстрикторных и ослабление вазодилататорных факторов могло быть причиной увеличения стрессобусловленного тонуса сосудов. На фоне введения аналога даларгина, наоборот, наблюдали увеличение уровня NO. Известно, что стимуляция рецепторов высокими дозами агонистов может приводить к снижению афинности или плотности рецепторов, что и могло явиться возможной причиной снижения уровня NO в ответ на введение даларгина. Стабилизированный аналог, скорость деградации которого могла быть ниже, чем у даларгина, смог взаимодействовать с рецепторами после восстановления их плотности или афинности. Cледствием такого взаимодействия вероятно и явился рост уровня NO (на 61,6 %, р = 0,003; 86 %, р = 0,000 в сравнении с фоном и стрессом соответственно) к концу иммобилизации.

Учитывая, что даларгин способен преодолевать ГЭБ в дозах от 1000 мкг/кг и выше [9], при периферическом введении его в дозе 1 мг/кг происходит активация не только периферических, но и центральных ОР. Гипертензивный эффект при активации центральных µ- и δ-ОР наблюдали и другие авторы [4].

Выводы

1. Активация ОР даларгином и его структурным аналогом в дозах, не проникающих через ГЭБ, сопровождалась снижением роста тонуса сосудов в условиях иммобилизационного стресса. Изменения уровня вазоактивных факторов (NO и ЭТ-1) на фоне активации ОР пептидами в данных дозах свидетельствуют о преимущественной роли NO в протективном эффекте опиоидов на стрессобусловленную вазоконстрикцию.

2. Активация ОР даларгином и его структурным аналогом в дозе, проникающей через ГЭБ, приводила к увеличению стрессобусловленного тонуса сосудов. Такой эффект даларгина сопровождался снижением NO и некоторым ростом ЭТ-1, в то время как провокационный эффект аналога сопровождался ростом уровня NO.

3. Стабилизация молекулы даларгина путём N-метилирования остатка фенилаланина приводила к более выраженному увеличению NO по сравнению с даларгином в дозах 10 и 1000 мкг/кг.

Рецензенты:

Соколова Л.В., д.б.н., профессор кафедры биологии и экологии человека Института естественных наук и биомедицины САФУ им. М.В. Ломоносова, г. Архангельск;

Щеголева Л.С., д.б.н., доцент, директор Учреждения РАН Института физиологии природных адаптаций УрО РАН, г. Архангельск.

Работа поступила в редакцию 10.11.2011.

Библиографическая ссылка