Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,118

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЛЕГОЧНЫХ МАКРОФАГОВ У МЫШЕЙ ОППОЗИТНЫХ ЛИНИЙ CBA ИC57Bl/6g

Потапова О.В., Черданцева Л.А., Шаркова Т.В., Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г., Ковнер А.В.
Изученыгенетически детерминированные морфофункциональные особенности легочных макрофагов у интактных мышей-самцов оппозитных линий С57Bl/6g и СBА. У мышей-самцов линии C57Bl/6g, в отличие от мышей линии CBA, больше величина численной плотности легочных макрофагов и относительно большее содержание макрофагов, обладающих секреторной активностью, определяемой по экспрессии маркеров внутриклеточных энзимов (миелопероксидазы, катепсина Д, индуцибельнойNO – синтазы).
оппозитные линии мышей CBA и C57Bl/6g
легочные макрофаги
PCNA
миелопероксидаза
катепсин Д
индуцибельная NO–синтаза

Инфекции, передающиеся воздушно-капельным путем, такие как грипп и ОРВИ, остаются в сфере особого внимания. Большинство возбудителей ОРВИ, особенно вирусы гриппа А, обладают тропностью к альвеолярному эпителию и вызывают у млекопитающих и человека заболевание c глубоким поражением легких [2].

Формирование местного иммунитета в легких как первой линии защиты организма при вирусных инфекциях осуществляется за счет легочных макрофагов,которые подразделяют на интерстициальные (периваскулярные, перибронхиальные) и альвеолярные. Все они входят в легочный компартмент системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Благодаря своей фагоцитозной и секреторной активности легочные макрофаги играют ключевую роль в инициации и развитии воспалительного процесса в легких [10].

Выраженность воспалительного ответа и особенности клеточных реакций в легких млекопитающих приинфекционных заболеваниях в определенной мере зависят от исходной фенотипически детерминированной реактивности мононуклеарных фагоцитов и их регуляции [5]. Рядом авторов выявлены межлинейные отличия реагирования различных систем организма мышей оппозитных линийСВА и С57Bl/6g на бактериальные и грибковые агенты - M.tuberculosis [3], С.albicans [1]. К сожалению, очень мало современных исследований посвящено изучению генетической детерминации иммунного ответа у млекопитающих при гриппе и ОРВИ [4,7]. На основании ранее описанных межлинейных различий можно предположить, что у млекопитающих с разной генетической программой имеют место как морфофункциональные различия клеток системы мононуклеарных фагоцитов, так и различные варианты реагирования этой системы на одинаковые патогены. Однако механизмы реализации генетически обусловленной предрасположенности или устойчивости к инфекциям, в том числе вирусным, обусловленные морфофункциональными характеристиками системы мононуклеарных фагоцитов,остаются малоизученными.

В связи с вышесказанным, целью данного исследования явилось изучение у мышей оппозитных линий СВА и С57Bl/6g межлинейных морфофункциональных особенностей легочных макрофагов как вероятного фактора детерминации характера иммунного ответа при вирусных инфекциях.

Методика исследования

В исследовании были использованы 40 мышей-самцов оппозитных линий СВА и С57Bl/6g двухмесячного возраста с массой тела 20-25 г, полученных из питомника Научно-исследовательского института клинической иммунологии СО РАМН. Мыши, выбранные для исследования, являются оппозитными по ряду признаков: по активности обменных процессов в печени [3], разной чувствительностью
к инфекционным агентам [1, 3, 4],структурно-функциональным характеристикам коры надпочечников [3], по количественному представительству клеток СМФ в различных органах [9].

Мышей-самцов выбранных оппозитных линий содержали на стандартной лабораторной диете со свободным доступом к воде и пище. Перед проведением эксперимента в течение 2-х недель их адаптировалик условиям содержания. Исследование проводилив соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755), с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации.

Для морфологического исследования использовали по 20 мышей каждой оппозитной линии, которых выводили из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе. Объектом исследования служили легкие. Образцы ткани получали из левого легкого (тотально) и из средних и нижних отделов правого легкого.

Для светооптического исследованияполученный материал после фиксации в 10 %растворе нейтрального формалина обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и ксилолов и заключали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином. Иммунофенотипирование легочных макрофагов, оценку их пролиферативной и функциональной активности проводили с помощью иммуногистохимического (ИГХ) анализа с использованием непрямого стрептавидинбиотинового метода с применением специфических моноклональных антител: к маркеру макрофагального ряда CD68 («DBS»), маркеру пролиферации PCNA («Novocastra»), к маркераминдуцибельной NO-синтазы (iNOS) («Novocastra»), лизосомальных протеаз - катепсина Д («DBS») и миелопероксидазы («DBS»).

Для проведения ИГХ-исследования срезы легких подвергали депарафинизации, регидратации, демаскировке антигенов в микроволновой печи мощностью 700W. Время экспозиции с первичными антителами составляло 30 мин при температуре 37°С. Затем срезы инкубировали со стрептавидин-пероксидазным комплексом, DAB-субстратом и дополнительно докрашивали гематоксилином Майера.

Визуализацию проводили на микроскопе AxioImagerA1 с фотокамерой AxioCam MRc (Carl Zeiss). Морфометрию структурных элементов тканей осуществляли с помощью окулярной сетки на 100 точек площадью 3,64х104 мкм2 (при определении численной и/или объемной плотности структур) и инструментов программы AxioVision (rel. 4,7). Определяли численную плотность (Nai)клеток СМФ легких в тестовой площади; средние величины диаметров макрофагов и их ядер. Исследовали долю клеток СМФ легких, экспрессирующих внутриклеточные энзимы, долю клеток СМФ с потенциально пролиферативной активностью. Полученный результат выражали в процентах от общего числа клеток СМФ легких.

Средние величины исследованных параметров определяли с использованием стандартного пакета программ «Statistica», применяли t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при р менее 0,05.

Результаты исследования

Методом обзорной световой микроскопии образцов ткани легких мышей оппозитных линий C57Bl/6g и CBАизучали топологию легочных макрофагов. При этом отмечали, что большая часть из них - 68 % - были представлены альвеолярными макрофагами, расположенными на поверхности альвеол, другие - макрофаги интерстиция - были распределены в межальвеолярных перегородках перибронхиально и периваскулярно. Величины численной плотности клеток макрофагов легких и их размеров у мышей линии C57Bl/6g были выше, чем у мышей линии СВА, на 22,6 % и 16 % соответственно. Диаметры ядер не имели достоверных межлинейных различий.

Большая численность макрофагов в легкихмышей-самцов линии C57Bl/6/g, возможно, обусловлена большим содержанием у них моноцитов в периферической крови по сравнению с мышами линии СВА [9], так как поддержание и увеличение пула клеток СМФ происходит, в основном, за счет рекрутирования моноцитов крови, имеющих костномозговое происхождение [10].

Однако в последнее десятилетие рядом автором выявлена способность легочных макрофагов к синтезу ДНК, что не позволяет исключить определенный вклад пролиферации in situ в поддержание численности альвеолярных макрофагов [8].Другие авторы связывают активацию синтеза ДНК в легочных макрофагах с усилением их синтезирующей и фагоцитарной активности, свидетельствующих о фенотипической диф-ференциации юных клеток СМФ [10].

В представленной работе исследована экспрессия ядерного маркера пролиферации PCNA в клетках СМФ легких мышей оппозитных линий. Показатель численной плотность PCNA-позитивных клетокбыл на 28,3 % выше у мышей линии C57Bl/6g по сравнению с аналогичным показателем у мышей линии СВА, что может свидетельствовать о высоком функциональном потенциале клеток системы мононуклеарных фагоцитов животных линии C57Bl/6g.

Известно, что взаимодействие макрофагов легких с вирусными частицами через Fc-peцепторы сопровождается активацией респираторного взрыва с избыточной секрецией провоспалительных цитокинов и хемокинов. Фагоцитоз и дальнейшая деградация микроорганизмов происходит в фаголизосомах макрофагов с помощью специализированных ферментных систем, наиболее значимыми из которых при вирусных инфекциях являются протеолитические ферменты из группы эндопептидаз - катепсин Д и миелопероксидаза, осуществляющие внутриклеточное расщепление белковых структур вирусов [4]. При ИГХ-исследовании функциональной активности макрофагов легких мышей-самцов оппозитных линий по экспрессии внутриклеточных энзимов было выявлено, что показатели численной плотности клеток, экспрессирующих лизосомальные протеазы (миелопероксидазу, катепсин Д), у мышей линии C57Bl/6g были большими в 1,3 раза, чем у мышей линии СBА (Табл.). При этом распределение иммунопозитивных гранул, содержащих секреторные протеазы, в цитоплазме клеток было равномерным у обеих линий животных.

Немаловажную рольв противовирусной защите отводят и системе оксида азота. Активацияиндуцибельной NO-синтазы (iNOS) в альвеолярных макрофагах в первые сутки после инфицирования вирусами гриппа А способствуетнакоплению оксида азота (NO), ингибирующего электрон-транспортные группы ферментов вирусов, участвующих в цикле Кребса и синтезе ДНК[5].Показатель численной плотности iNOS-позитивных клеток СМФ в легких мышей-самцов линии C57Bl/6g был выше на 20,5 % в сравнении с величиной аналогичного показателя у мышей-самцов линии СВА (табл.).  

Морфофункциональные характеристики легочных макрофагов интактных мышей оппозитных линийС57Bl/6g и СВА (M±m)

Параметрыисследования

Линии животных

Интактные мыши линии C57Bl/6/g

Интактные мыши линии CBA

Численная плотность CD68+ легочных макрофагов (Nai)

(тестовая площадь 3,64х105 мкм2)

- из них PCNA+- клетки,  %

- из них экспрессирующие:

iNOS,  %

CathepsinD,  %

Myeloperoxidase,  %

10,12 ± 0,96

 

12,2 ± 0,56

 

35,96± 1,97

47,43± 2,86

35,17± 2,47

8,25 ± 0,26a

 

9,51 ± 0,91а

 

28,61 ± 2,67а

36,02 ± 2,79а

26,67 ± 2,42а

Средний диаметр альвеолярных

макрофагов, мкм

9,44 ± 0,15

7,92 ± 0,14а

Средний диаметр ядра альвеолярных

макрофагов, мкм

5,63 ± 0,11

5,53 ± 0,08

Примечание: «a» - достоверность отличия величин рассматриваемых параметров у мышей оппозитных линий C57Bl/6/g и CBA.

Учитывая полученные результаты, можно сделать предположение о более высоких функциональных возможностях СМФ мышей линии C57Bl/6g, что соотносится с литературными данными об устойчивости животных данной линии к воздействию многих патогенных факторов, провоцирующих формирование различных патологических состояний легких [6]. Возможно, легочные макрофаги мышей линии С57Bl/6g как регуляторы противовирусного ответа будут демонстрировать большую фагоцитозную и секреторную активность при моделировании вирусных инфекций с последующей элиминацией возбудителя, что, в свою очередь, может обусловить более ранний и полноценный противовирусный ответ.

Таким образом, выявленные межлинейные различия по количественному представительству и функциональным возможностям клеток СМФ легких у мышей линий С57Bl/6g и СBА указывают на генетическую детерминацию морфофункционального состояния легочного компарт-мента СМФ. Это дополняет уже имеющиеся сведения об анатомо-физиологических особенностях данных линийи позволяет рекомендовать их в качестве моделей для изучения генетически детерминированных особенностейпротивовирусного ответа млекопитающих.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013гг.», госконтракт № 02.740.11.0709.

Список литературы

  1. Система мононуклеарных фагоцитов в постнатальном периоде у мышей, перенесших
    внутриутробное кандидозное инфицирование, при экспериментальном туберкулезе / А.П. Надеев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.2006.Т.141.№1.
    С. 103-106.
  2. Структурные изменения легких у мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц H5N1 субтипа / Л.В. Шестопалова [и др.] // Вестник НГУ.2008.Т.6, вып. 3, ч.2. С. 3-10.
  3. Шкурупий В.А. Туберкулезный гранулематоз. Цитофизиология и адресная терапия.М.: Изд-во РАМН, 2007. С.109-150.
  4. Influenza A virus elevates active cathepsin B in primary murine DC / Burster T.[et al.]// Int. Immunol. 2007. 19. P. 645-655.
  5. Pulmonary alveolar epithelial inducible NO synthase gene expression: regulation by inflammatory mediators / Gutierrez H.H.[et al.]// Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 1995. 268. P. 501-504.
  6. Hayden F.G., Hay H.J. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992. 176. P. 119-130.
  7. Low-dose arsenic compromises the immune response to influenza A infection in vivo / Kozul C.D.[et al.]// Environ. Health Perspect. 2009. 117(9). P. 1441-1447.
  8. Landsman L, Jung S. Lung macrophages serve as obligatory intermediate between blood monocytes and alveolar macrophages// J Immunol.2007.179(6). Р.3488-94.
  9. Murciano C. [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008. 53(2). P. 214-221.
  10. Transcriptome profiling of primary murine monocytes, lung macrophages and lung dendritic cells reveals a distinct expression of genes involved in cell trafficking / Zasłona Z. [et al.]// Respir Res. 2009. Р. 10-122.

Библиографическая ссылка

Потапова О.В., Черданцева Л.А., Шаркова Т.В., Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г., Ковнер А.В. МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЛЕГОЧНЫХ МАКРОФАГОВ У МЫШЕЙ ОППОЗИТНЫХ ЛИНИЙ CBA ИC57Bl/6g // Фундаментальные исследования. – 2010. – № 10. – С. 34-39;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=13935 (дата обращения: 20.08.2018).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252