Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,252

Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Зайцева О.О., Соломина О.Н., Якшина С.А., Худяков А.Н., Лаптев Д.С.

Разработаны ресурсосберегающие методы замораживания и хранения ядерных клеток крови при субумеренно - низкой (-20ºС), умеренно - низкой (-40ºС) и низкой (-80ºС) температурах, которые позволяют сохранять морфофункциональные свойства лейкоцитов на высоком уровне в течение различных сроков холодового анабиоза. В основу методов легли: разработка криозащитных растворов, нелинейных экспоненциальных программ и способа отогрева.

Экспериментально были выявлены оптимальные составы хладоограждающих растворов для указанных температур. Основным ингредиентом всех растворов служил криопротектор экзо- и эндоцеллюлярного действия - ГМБТОЭМ, к которому в качестве «реставрирующих» компонентов добавляли ОМЭМС (для -20ºС и -80ºС) - мембраностабилизиратор, антигипоксант, антиоксидант, и фумарат натрия (для -40ºС) - антигипоксант биоэнергетической направленности. Так как низкая температура (-80ºС) является более разрушающей для лейкоцитов, то дополнительно в состав раствора был введен криопротектор эндоцеллюлярного действия ДМСО. На все хладоограждающие растворы получены патенты РФ.

Для введения лейкоцитов в криоанабиоз была выбрана медленная нелинейная экспоненциальная программа замораживания, которая позволяет разным популяциям клеток входить в холодовой анабиоз на разных его уровнях. При использовании данного режима замораживания не наблюдается выброса кристаллизационного тепла и рекристаллизации, в отличие от линейной принудительной программы и не применяется жидкий азот. Он значительно увеличивает энергетические и экономические затраты на осуществление криотехнологии, более того, для работы с жидким азотом требуется дорогое криогенное оборудование и обслуживание высокоспециализированного персонала, что также усложняет и делает высокозатратным данную криотехнологию.

Перед замораживанием лейкоконцентрат в пластикатном контейнере «Компопласт 300» смешивали 1:1 с оптимальным хладоограждающим раствором, экспонировали в течение 20 мин, затем погружали в металлическую 4-х литровую ванну электроморозильника «Криостат», заполненную 96ºС этиловым спиртом, охлажденным до -28ºС. Далее биообъект охлаждали до заданной температуры (-20ºС, -40ºС, -80ºС) и переносили для хранения в электроморозильники, настроенные на указанные отрицательные температуры.

Весьма важным этапом в разработке криотехнологии является размораживание биообъекта. Применяли быстрый отогрев в 20-литровой водяной ванне (+38ºС) в течение 45-60 сек при интенсивном покачивании контейнера во избежание образования тепловой «подушки» и возникновения рекристаллизации в биообъекте при оттаивании.

Разработанные технологии позволяют сохранить при субумеренно-низкой температуре (-20ºС) 71,67±10,82% фагоцитарно-активных клеток в течение 21 суток, при умеренно-низкой (-40ºС) - 92,20±6,42% в течение 30 суток и при низкой (-80ºС) - 77,44 ±17,17% в течение 180 суток (срок наблюдения).

Таким образом, предложенные технологии являются не только эффективными и энергосберегающими, но и доступными для широкого применения в учреждениях биологического и медицинского профиля.


Работа представлена на V всероссийскую научную конференцию «Новейшие технологические решения и оборудование», г.Москва, 14-16 мая, 2007г. Поступила в редакцию 24.10.07г.