Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

На протяжении нескольких десятилетий коллаген, его строение и свойства являются весьма популярной темой исследований российских и зарубежных ученых. Он получил широкое применение в медицине, полиграфии, пищевой, комбикормовой и микробиологической промышленностях [1, 4]. Во всем мире традиционно получение коллагена из спилка шкур крупного рогатого скота (КРС). Однако из-за болезни бешенства и угрозы передачи вируса человеку встал вопрос о поиске альтернативных источников. В 2000 г. в Европе стартовал большой проект, объединивший семь компаний и научных институтов по изучению коллагена из отходов переработки морских рыб.

В России в связи с санкциями Евросоюза, США и других сторонников существенно сократился импорт рыбного сырья и продуктов. Поэтому актуален поиск замены зарубежного сырья на отечественное. По мнению авторов [3, 10, 9], источниками коллагена могут служить побочные продукты и отходы при глубокой переработке прудовых рыб. Использование таких источников содействует охране окружающей среды и отвечает принципам ресурсосбережения и инновационности технических решений. Максимальное и рациональное использование рыб внутренних водоемов поддерживается Правительством РФ, об этом свидетельствуют важнейшие стратегические документы: «Водная стратегия Российской Федерации на период до 2020 года», «Стратегия развития рыбохозяйственного комплекса Российской Федерации на период до 2020 года». Обозначенные направления развития отрасли получили должное внимание и на региональных уровнях. Исследования проводили в Воронежском государственном университете инженерных технологий, в рамках Государственного задания № 2014/22 НИР № 3017.

Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали шкуры наиболее распространенных в ЦЧР прудовых рыб: сазана, толстолобика, щуки. Объекты сравнивали со спилком шкур крупного рогатого скота, производимого на территории Тверской области. Рыбы вылавливали в осенней период массой 700–1500 г. Шкуры отделяли вручную в лабораторных условиях при предварительном снятии чешуи, отделении хвоста, головы, жабр, плавников, зачистки внутренней поверхности от жировых тканей и прирезей мышечной ткани.

Гистоморфологические исследования проводили методом получения ультратонких срезов с дальнейшим окрашиванием по методу импрегнации серебром по Шультце в модификации Гольджи [8]. Физико-химические свойства рыбных коллагенов, имеющих практическое значение в получении лекарственных средств (подлинность – качественная реакция; прозрачность, цветность, вязкость, массовая доля сухих веществ – ГФ ХI; рН – ГФ ХI и потенциометрически, массовая доля коллагена – ГОСТ 23401-78 «Метод определения оксипролина» [2, 7, 6]), определяли в соответствии с фармакопейной статьей предприятия (ФСП-42-1221-06 1 ЗАО «Лужский завод «Белкозин») [7]. В коллагеновых дисперсиях определяли фракционный состав белков на основании их растворимости по методам [2], электрофоретическую подвижность и молекулярную массу на установке вертикального электрофореза в денатурирующих условиях с использованием маркерных белков AppliChem (ProductNo.A4402), в соответствии с инструкцией к прибору. Структурные особенности по спектру поглощения в инфракрасной области идентифицировали на аппарате Vertex 70 [5].

Результаты исследования и их обсуждение

При проведении гистоморфологических исследований готовили ультратонкие поперечные срезы шкур рыб с последующим окрашиванием и микроскопированием объектов. Как видно на рис. 1, рыбные шкуры в дермальном слое обнаруживали рыхлые структуры соединительнотканных волокон и меньшую толщину по сравнению со спилком шкур животных (КРС), что объективно связано с видовой принадлежностью объектов исследования.

Данные определения фракционного состава белков (табл. 1) доказывают превалирование щелочерастворимой фракции во всех объектах, что свидетельствует о наличии соединительнотканных волокон белковой природы, отчетливо видных на микроструктурных срезах.

Для предварительной оценки технологической пригодности коллагенов реализовали известную технологию, применяемую в условиях ЗАО «Лужский завод «Белкозин» в лабораторных условиях с учетом авторской коррекции параметров процессов для получения дисперсии [9].

Сравнительные данные по реализации усовершенствованной технологии коллагеновой дисперсии из рыбного сырья и дисперсии, полученной и спилка шкур крупного рогатого скота, представлены в табл. 2.

а) б) в) г)

Рис. 1. Микроструктура дермальных слоев шкур в поперечном срезе. Увеличение ×200. Окраска по Гольджи : а) спилок шкуры КРС б) щуки в) сазана г) толстолобика

Таблица 1

Фракционный состав шкур рыб и спилка КРС

Как видно из данных табл. 1, дисперсии близки по свойствам, но имеют и некоторые отличия, связанные, по всей вероятности, с особенностями структуры коллагенов.

Использование аппарата Vertex 70 для идентификации структурных особенностей коллагена по спектру их поглощения в инфракрасной области дает возможность прямого измерения жидких, твердых субстанций без дополнительного выделения или получения таблетки с калием бромидом, что позволяет провести эксперимент быстро, не разрушая анализируемые структуры. Измерение проводили в среднем диапазоне волн в области от 4000 до 400 см^-1.

В ходе экспериментальных исследований обнаружены характерные полосы поглощения: 3335 – 2908, 2404 – 16551611,1502,1493,1211,893,611 см^-1, что соответствует соединениям типа (CH3,С-H) (3335-2908); (NO2,N-C≡N)(2404-1655); (C=0,NO2)(1611); (C-C-H)(1431,1211); (893-623) (-C-C,≡C-H). Эти данные подтверждают молекулярную природу коллагена (рис. 2).

Таблица 2

Сравнительные характеристики субстанций из спилка КРС и шкуры толстолобика

Рис. 2. ИК-спектроскопия коллагена

Результаты электрофоретической подвижности (рис. 3) указывают на отличие в структуре, а следовательно, в функциях коллагенов различного происхождения. На элетрофореграммах видно, что миграция белков из спилка шкур крупного рогатого скота находится на границе 212 КДа и выше с небольшим содержанием компонентов при значениях молекулярной массы 60–212 кДа. Рыбные коллагены также характерны наличием высокомолекулярных фракций на уровне 212 КДа с более выраженным содержанием белков при значениях молекулярной массы 40–212 кДа. Такая характеристика рыбных коллагенов совпадает с данными польских и украинских авторов об особенностях строения рыбных коллагенов [3].

Рис. 3. Электрофореграммы коллагеновых субстанций животного и рыбного происхождения: дорожки 1, 4, 7, 10 – маркеры молекулярной массы; дорожки 2, 5, 8 – образец, полученный из шкуры рыб; дорожки 3, 6, 9 – образец, полученный из спилка шкуры КРС

Таблица 3

Скорость выплавления желатина

Особенности структуры проявляются в более глубокой выплавке желатина, протекающей в более короткий временной период, в случае объектов рыбного происхождения (табл. 3).

Заключение

Проведенные гистоморфологические исследования и анализ фракционного состава вторичного сырья животного и рыбного происхождения, показал наличие коллагена в обоих случаях.

Были получены коллагеновые дисперсии, близкие по свойствам, но имеющие и различия, связанные с особенностями строения.

В ходе проведения ИК-спектроскопии коллагена, были обнаружены характерные полосы, соответствующие соединениям типа (CH3,С-H); (NO2,N-C≡N); (C=0,NO2); (C-C-H); (-C-C,≡C-H), что подтверждает его молекулярную структуру.

Электрофоретическое фракционирование показало, что белки коллагеновых субстанций представляют собой гетерогенные системы с различной подвижностью фракций под действием электрического поля. Рыбные коллагеновые субстанции состоят из белковых фракций, молекулярная масса которых находится в диапазоне от 212 до 20 кДа.

Структурные особенности влияют на химические свойства. Выплавка желатина протекает быстрее в случае рыбного сырья, что говорит о коллагене, полученном из шкуры рыб, как о достойном конкуренте животному аналогу.

Рецензенты:

Попова Т.Н., д.б.н., профессор, зав. кафедрой медицинской биохимии и микробиологии, ФГБОУ ВПО «ВГУ», г. Воронеж;

Дерканосова Н.М., д.т.н., профессор, зав. кафедрой товароведения и экспертизы товаров, декан факультета технологии и товароведения, ФГБОУ ВПО «Воронежский ГАУ», г. Воронеж.