Синдром Рейно (СР) – это эпизодическое нарушение периферической циркуляции [2]. Различают первичный СР (или болезнь Рейно) и вторичный СР. Наиболее часто вторичный СР ассоциируется с системной склеродермией [2]. Кроме того, синдром Рейно может развиться в результате воздействия профессиональных факторов, наиболее частыми являются вибрация, охлаждение и контакт с поливинилхлоридом [2]. Механизмы развития СР сложны и недостаточно изучены. Подчеркивается роль реперфузии и свободных кислородных радикалов в генезе ишемии при СР [3, 4, 7]. Антиоксидантная система организма представлена целым рядом ферментов, призванных нивелировать патогенный эффект активных форм кислорода (АФК) [3]. Одними из важных звеньев системы антиоксидантной защиты являются супероксиддисмутаза (СОД – EC 1.15.1.1) и глутатионредуктаза (ГР – ЕС 1.6.4.2). Учитывая важную роль иммунологических сдвигов в развитии системного склероза [5, 6], можно предположить, что одним из механизмов нарушения работы ферментных систем могут быть аутоантитела к энзимам.
Цель исследования: выявление клинико-иммунологических особенностей при разных формах синдрома Рейно.
Материалы и методы исследования
Под наблюдением находилось 83 больных с достоверным диагнозом ССД, 30 – с первичным синдромом Рейно, 25 пациентов с локальной вибрационной болезнью, а также 30 практически здоровых лиц – доноров станции переливания крови, в возрасте от 25 до 47 лет, среди которых 17 женщин и 13 мужчин.
У 100 % больных ССД диагностирован синдром Рейно. Антитела к СОД определяли в сыворотке крови больных по разработанному нами варианту непрямого иммуноферментного анализа [1], с использованием иммобилизированных антигенных форм энзима.
Больные ССД. В исследование были включены 83 больных, в том числе 81 (97,6 %) – женщина и 2 (2,4 %) мужчины. Средний возраст больных – 50,3 ± 11,9, продолжительность заболевания 8,3 ± 7,1 лет. У 56 (67,5 %) больных определялась лимитированная форма болезни, у 27 (32,5 %) – диффузная, а в 11 случаях отмечена перекрестная форма (overlap-синдром). У 49 (59 %) больных диагностировано подострое течение процесса, у 28 (33,7 %) – хроническое, а у 6 (7,2 %) пациентов – острое. Согласно индексам активности болезни, разработанным Европейской группой по изучению ССД, I степень активности диагностирована у 23 (27,7 %) человек, II – у 46 (55,4 %), III – у 14 (16,9 %). У всех больных определялся модифицированный кожный счет. Среднее значение кожного счета составило 12,37 ± 7,18.
Больные с синдромом Рейно. Под наблюдением находилось 30 больных с первичным синдромом Рейно: 18 (60 %) – женщины, 12 (40 %) – мужчины. Средний возраст больных – 31,6 ± 13,4, продолжительность болезни – 2,9 ± 1,8 лет. У всех больных отмечался 2-фазный характер изменения цвета (цианоз-гиперемия), не отмечалось выраженных болевых ощущений и не было трофических нарушений.
Больные с вибрационной болезнью. Под наблюдением находилось 25 больных с локальной вибрационной болезнью, из них мужчины – 100 %. Средний возраст пациентов – 42 ± 3,1, продолжительность болезни – 3,5 ± 1,2 лет, длительность работы, связанной с вибрацией, составила в среднем 6,3 ± 3,1 лет. У 70 % больных отмечалась выраженная форма синдрома Рейно (II, III, IV степени).
Антитела к СОД, ГР определяли в сыворотке крови больных по разработанному нами варианту непрямого иммуноферментного анализа [1], с использованием иммобилизированных антигенных форм энзимов и иммунопероксидазного конъюгата производства НИИ ЭМИ им. Гамалеи.
Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля. В качестве антигена при определении антител к СОД использовали препарат супероксиддисмутазы из эритроцитов человека (Superoxide Dismutase from human erythrocytes, Cat. № S 9636), лиофилизированный порошок с активностью 3000 ед./мг, концентрация белка в нем составила 98 мг/мл (биуретовый метод). В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 10 мкг/мл. При определении антител к ГР – препарат глутатионредуктазы (Glutathione Reductase from Baker¢s yeast, Cat. № G 3664), представляющий собой суспензию в 3,6 М растворе сульфата аммония (рН = 7,0) с активностью 240 ед./мг белка (биуретовый метод). В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 20 мкг/мл. Активность СОД определяли по методу С. Чевари и соавт. (1993), ГР по методу Hosoda и Nakamura, описанному М.А. Шифриным (1977). Изучение влияния антител к СОД на ее активность проводили в опытах in vitro с растворимой и иммобилизированной формами фермента. Источником специфических иммуноглобулинов служили сыворотки больных ССД с заранее высоким титром антител (экстинкция 0,2–0,6 е.о.п.). Всем пациентам проводилось тщательное клинико-лабораторное и инструментальное обследование. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программных пакетов «Statistica 6.0».
Результаты исследования и их обсуждение
Здоровые лица. При исследовании сывороток здоровых лиц уровень антител к СОД составил (0,057, 0,065), к ГР – (0,05, 0,057). Общая активность СОД в группе здоровых лиц составила 37,1 ± 3,3, ГР – 117,2 ± 2,8. Существенных различий уровня антител к энзимам в зависимости от пола, возраста не выявлено.
Больные с первичным синдромом Рейно. Повышенные значения антител выявлены: к СОД – у 5 (16,7 %) человек, к ГР – у 2 (6,7 %). Полученные значения имеют статистически значимые отличия от группы здоровых: U-test = 35,0, p = 0,0000; 24, p = 0,0000 – соответственно (табл. 1).
Значения активности изучаемых ферментов были следующие: СОД – 32,9 ± 6,2; ГР – 107,9 ± 11,4. Статистически значимых связей между изучаемыми показателями и возрастом, длительностью болезни не обнаружено. Активность фермента имела большую тенденцию к снижению по сравнению со здоровыми лицами, что, вероятно, связано с большим напряжением антиоксидантной системы при наличии синдрома Рейно, приводящего к гипоксии тканей. Выраженность уменьшения активности энзимов достоверно меньше, чем в группе больных ССД (p < 0,005).
Больные вибрационной болезнью. При исследовании сывороток больных антитела к изучаемым энзимам обнаружены у 2 пациентов (8 %) к СОД и у 1 больного к ГР, что, вероятно, связано с выраженной прогрессией их заболевания (III стадия). Активность ферментов в группе больных достоверно ниже по сравнению с здоровыми (p < 0,005) и имела тенденцию к большему снижению по сравнению с больными с первичным синдромом Рейно (p > 0,02) (акт СОД – 28,2 ± 1,1, ГР – 103 ± 2,5).
Таблица 1
Показатели активности СОД и содержание антител к ферментам в сыворотке крови здоровых лиц, больных ССД, вибрационной болезнью, с первичным СР
|
Контингент |
N |
Статист. показатели |
АТ к СОД |
АТ к ГР |
|
Здоровые |
30 |
М m ДИ |
0,061 0,002 0,057…0,065 |
0,054 0,001 0,05…0,057 |
|
Больные ССД (группа в целом) |
83 |
М m ДИ |
0,18*°′ 0,001 0,16…0,2 |
0,14*°′ 0,006 0,13…0,15 |
|
Больные с первичным СР |
30 |
M m ДИ |
0,1* 0,001 0,08…0,13 |
0,07* 0,003 0,067…0,08 |
|
Больные с вибрационной болезнью |
25 |
M m ДИ |
0,074 0,002 0,062…..0,083 |
0,06 0,002 0,058…..0,062 |
Примечания: М – среднее значение, m – ошибка репрезентативности, ДИ – доверительный интервал; *достоверные отличия с донорами; ° достоверные отличия с больными ПСР; ′ – достоверные отличия с больными вибрационной болезнью.
Больные ССД. Повышенные значения антител к изучаемым ферментам выявлены: к СОД у 57 (68,7 %) пациентов, к ГР – у 55 (66,3 %). Показатели активностей изучаемых ферментов составили: СОД – 23,9 ± 5,9; ГР – 77,6 ± 16,1, причем отмечалась тенденция к более выраженному снижению активности по мере нарастания активности процесса. В ходе работы нами выявлены статистически значимые корреляционные связи между уровнем всех изучаемых антител и активностью патологического процесса: Ат к СОД – Spearman R = 0,57, p = 0,0000, Ат к ГР – Spearman R = 0,6, p = 0,0000. Данные, полученные для всей группы больных ССД, имеют статистически значимые отличия от уровня у здоровых лиц, больных ПСР и вибрационной болезнью (табл. 1).
При анализе полученных данных в группе больных с I степенью активности повышенные уровни антител к СОД обнаружены у 6 (26,1 %) пациентов, к ГР – у 5 (21,7 %), при сравнении с больными ПСР – только уровень активности ГР статистически значимо отличался от группы больных – M-W-U test = 111, p = 0,04. Активность II: выявлены повышенные уровни антител к СОД у 37 человек (80,4 %), ГР – у 37 (80,4 %). III степень активности: повышенные уровни антител выявлены: к СОД у всех больных (100 %), к ГР – у 13 человек (92,9 %). Все полученные данные имеют статистически значимые отличия от уровня у здоровых лиц, больных ПСР и вибрационной болезнью.
Кроме того, нами выявлено, что все больные ССД с высоким содержанием антител к изучаемым ферментам имели высокую степень синдрома Рейно (II–IV). Известно, что СР приводит к ишемии и, следовательно, гипоксии тканей [3]. В результате этих процессов происходит усиление пероксидации мембранных структур, апоптоза клеток, что при снижении антиоксидантной защиты, в том числе, вероятно, вследствие образования антител к ферментам, наблюдающейся при системных заболеваниях соединительной ткани, способствует развитию различной висцеральной патологии [3, 4]. Всем больным проводилась капилляроскопия сосудов ногтевого ложа. Количество капилляров в группе больных ПСР составило 10,35 ± 2,83, что имеет статистически значимые отличия от здоровых лиц (M-W U-test = 140, p = 0,005), количество аваскулярных зон, наличие кустовидных деформаций сосудов, появление экстравазатов – не имеют статистически значимых отличий от здоровых. Среднее количество расширенных капилляров составило 1,24 ± 1,6, данный показатель статистически значимо отличается от здоровых лиц – M-W U-test = 154,5, p = 0,01. Статистически значимых корреляционных связей полученных результатов с возрастом, длительностью заболевания не было отмечено. Таким образом, при капилляроскопии сосудов ногтевого ложа при ПСР преобладали явления умеренного вазоспазма без деформации сосудов и аваскулярных зон.
В группе больных вибрационной болезнью количество капилляров составило 8,3 ± 2,8, количество аваскулярных зон – 1,2 ± 0,7, что имеет статистически значимые отличия от здоровых лиц и больных ПСР (р = 0,003, р = 0,005 соответственно). Статистически значимых корреляционных связей полученных результатов с возрастом не отмечено, но они определяются в зависимости от продолжительности болезни.
Количество капилляров в группе больных ССД составило в среднем 6,5 ± 1,8, аваскулярных зон – 1,94 ± 0,9, кустовидных капилляров – 1,7 ± 1,5, экстравазаты – 0,06 ± 0,24, расширенные капилляры – 2,4 ± 1,8. Все показатели больных ССД статистически значимо отличались от показателей здоровых и больных ПСР и вибрационной болезнью.
Из общепринятых иммунологических показателей обращает на себя внимание определение АНФ, Scl-70 и антицентромерных антител (АЦА). В группе больных с ПСР и вибрационной болезнью выявлено определение положительного АНФ у 5 (16,7 %) и 2 (8 %) человек соответственно, Scl-70 и АЦА – не определялись. У больных ССД АНФ обнаружен у 70 (84,3 %) пациентов, Scl-70 у 34 (40,1 %), а АЦА у 43 (51,8 %) человек. Таким образом, при ПСР и вибрационной болезни отмечаются менее выраженные иммунологические изменения.
В опытах in vitro, проведенных для определения патогенетической роли антител к изучаемому ферменту, нами были выявлены следующие закономерности, представленные в табл. 2.
Таблица 2
Сравнительная характеристика активности иммобилизированной и растворимой форм фермента после взаимодействия с антителами
|
Фермент |
Форма фермента (исходная активность) |
Активность фермента после взаимодействия |
||
|
с антителами (n = 30) |
с сывороткой доноров |
контроль (физ. раствор) |
||
|
СОД (ед./мг) |
Иммобилизированная (34,3 ед./мг) |
10,2 ± 0,06* |
33,4 ± 0,14 |
37,3 ± 0,05 |
|
Растворимая (32,2 ед./мг) |
19,3 ± 0,07* |
32,3 ± 0,1 |
37,5 ± 0,07 |
|
Примечание. * – достоверные отличия с контролем и донорами.
При проведении исследования активности иммобилизированной формы фермента после взаимодействия с антителами in vitro, нами выявлено снижение активности энзима на 60–70 % по сравнению с исходной, кроме того, получены статистически достоверные различия с контролем (физиологический раствор) и донорами (р < 0,05) (табл. 2). Эти изменения связаны, вероятно, с блокированием активного центра фермента, являющегося одновременно и антигенной детерминантой. При исследовании взаимодействия растворимой формы энзима нами обнаружено снижение активности фермента на 30–40 %, вероятно, это можно объяснить конформационными изменениями структуры молекулы, приводящими к неполному совпадению активного центра фермента и его антигенной детерминанты. Таким образом, можно предположить, что выявляемые нами антитела к ферменту антиоксидантной системы являются одной из вероятных причин снижения их энзиматической активности у больных с системным склерозом.
Итак, в крови больных с системной склеродермией выявляются антитела к СОД, ГР, продукция которых увеличивается с возрастанием активности процесса, наличием более тяжелых форм течения заболевания и сопровождается снижением активности фермента. Следовательно, одной из причин угнетения антиоксидантной активности, вероятно, могут явиться аутоантитела к энзиму. В крови больных с первичным синдромом Рейно выявлены достоверно менее выраженные изменения антиоксидантной системы и несущественная продукция антител к энзимам. Обнаружение антител к ферментам в крови больных с первичным СР может, вероятно, служить прогностически неблагоприятным фактором возможного начала системного заболевания соединительной ткани, поэтому эти больные требуют тщательного наблюдения в динамике. Кроме того, особого внимания заслуживают пациенты с выраженными капилляроскопическими изменениями.
В группе больных с СР на фоне вибрационной болезни отмечается выраженное угнетение активности ферментов и незначительная продукция антител к СОД, ГР по сравнению с больными ССД. Это, вероятно, связано с другими механизмами развития синдрома Рейно, меньшим участием аутоантителогенеза. Угнетение активности ферментов обусловлено, видимо, высоким напряжением антиоксидантной системы на фоне выраженной гипоксии и продукции АФК. Таким образом, синдром Рейно, имеющий схожую клиническую картину, может определяться разными патогенетическими механизмами развития.
Рецензенты:
Гонтарь И.П., д.м.н., профессор, зав. клинико-иммунологической лабораторией, ФГБНУ НИИ КиЭР, г. Волгоград;
Зборовская И.А., д.м.н., профессор, директор, ФГБНУ НИИ КиЭР, г. Волгоград.