Высокотехнологичные методические подходы молекулярной медицины с использованием современных постгеномных технологий позволяют выяснить ранее неизвестные механизмы развития осложненной беременности. К числу таких технологий относится протеомный анализ, дающий представление о совокупности белков исследуемой ткани и создающий качественно новые возможности для системных поисков молекулярных маркеров патологического процесса [3, 12].
Поскольку развитие беременности связано с молекулярно-клеточными изменениями не только в организмах матери и плода, но и в плаценте, обеспечивающей их взаимосвязь, изучение плацентарного протеомного профиля может дать важную информацию о механизмах развития акушерской патологии. Лидирующими осложнениями беременности, приводящими к пренатальной заболеваемости и смертности, являются преэклампсия и ЗРП. Однако данные о протеомном спектре плаценты при этих состояниях малочисленны и неоднозначны [6].
Целью настоящей работы явилось изучение протеомного профиля плаценты при преэклампсии и ЗРП.
Материалы и методы исследования
Исследованы плаценты 52 женщин в возрасте от 23 до 33 лет (в среднем 25,9 ± 0,4 года), составившие 3 группы. В 1-ю группу вошли 15 женщин с неосложненным течением беременности и родов, во 2-ю – 18 женщин, у которых беременность осложнилась преэклампсией средней степени тяжести в соответствии с международной классификацией болезней (МКБ-10, код-014.0), в 3-ю группу – 19 женщин, с ассиметричной формой ЗРП (МКБ-10, код – Р.05.0). По возрасту, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу пациентки обследуемых групп были сопоставимы.
Материалом исследования служили плаценты, взятые сразу после родов. Протеомные карты плацентарной ткани получали с помощью высокоразрешающего двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (приборы Protein IEF Cell и Protean II xi Multi-Cell, «Bio-Rad», США), который включал в первом направлении изоэлектрическое фокусирование (IPC – стрипы рH 3,0–10,0 , прибор IEF Cell, «Bio-Rad», США), во втором – вертикальный электрофорез (8–16,5 % гель, прибор Protein II xi Multi-Cell, «Bio-Rad», США). Для получения аналитических гелей использовали загрузку белка – 180 мкг/гель. Окрашивание белковых пятен осуществили азотнокислым серебром, затем фореграммы сканировали и анализировали с использованием пакета программ PDQuest («Bio-Rad», США). Идентификацию белков после вырезания пятен из геля и процедуры трипсинолиза проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии [4] на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker», Германия) с помощью программы Mascot MS Search (Matrix Science, Великобритания) и баз данных NCBI и Swiss-Prot.
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы StatSoft. Jnc.). Достоверность различий между сравниваемыми группами: для каждого белка отличия определяли с помощью c2-критерия и четырехпольных таблиц сопряженности качественных признаков. Результаты оценивали как статистически значимые при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенный протеомный анализ позволил идентифицировать белки с различными функциями и свойствами, обеспечивающими возможность многосторонней регуляции метаболизма плаценты, значительная часть которых обнаруживается во всех обследованных группах женщин. В то же время белковый состав плацентарной ткани при физиологической и осложненной беременности имеет определенные отличия (таблица).
Белки плаценты, идентифицированные при физиологической беременности, ЗРП и преэклампсии
|
№ п/п |
Название белка |
№ в базе Swiss-Prot |
Mm, кДа |
pI |
Физ. бер. |
ЗРП |
Пре- экл. |
|
1 |
α-актинин-4 |
O43707 |
105.4 |
5.2 |
– |
+* |
+* |
|
2 |
Эндоплазмин |
P14625 |
92.4 |
4.9 |
– |
+* |
+* |
|
3 |
β-тропомиозин |
P07951 |
32.8 |
5.1 |
– |
+* |
+* |
|
4 |
Виментин |
P08670 |
53.7 |
4.4 |
– |
+** |
– |
|
5 |
Аконитатгидратаза, митохондриальная |
Q99798 |
85.4 |
7.9 |
– |
–** |
+* |
|
6 |
Белок теплового шока 60 кДа, митохондриальный |
P10809 |
61.0 |
4.8 |
– |
–** |
+* |
|
7 |
Пероксиредоксин-4 |
Q13162 |
30.8 |
5.2 |
– |
–** |
+* |
|
8 |
Белок 14-3-3 эпсилон |
P62258 |
29.2 |
5.8 |
– |
–** |
+* |
|
9 |
β-актин |
P60709 |
41.7 |
5.2 |
+ |
–* |
–* |
|
10 |
α-субъединица 6 типа протеасомы |
P60900 |
38.6 |
5.7 |
+ |
–* |
–* |
|
11 |
60S кислый рибосомальный белок |
P05388 |
34.2 |
5.6 |
+ |
–* |
–* |
|
12 |
Аннексин A4 |
P09525 |
32.9 |
5.4 |
+ |
–* |
–* |
|
13 |
Субъединица 2 комплекса Arp 2/3 |
O15144 |
32.1 |
6.2 |
+ |
–* |
–* |
|
14 |
α-тропомиозин |
P09493 |
32.7 |
4.2 |
+ |
–* |
–* |
|
15 |
γ-актин |
P63261 |
41.7 |
5.3 |
+ |
–*/** |
+ |
|
16 |
Актин-подобный белок 2 |
P61160 |
38.7 |
6.3 |
+ |
–*/** |
+ |
|
17 |
Актин-подобный белок 3 |
P61158 |
52.3 |
5.4 |
+ |
–*/** |
+ |
|
18 |
Нейтральная α-гликозидаза AB |
Q14697 |
96.8 |
5.7 |
+ |
–*/** |
+ |
|
19 |
γ-аминобутиральдегид-дегидрогеназа |
P49189 |
53.8 |
5.6 |
+ |
–*/** |
+ |
|
20 |
Цитратсинтаза, митохондриальная |
O75390 |
38.0 |
7.0 |
+ |
–*/** |
+ |
|
21 |
Дельта (3.5)-Дельта (2.4)-диеноил-КоА- изомераза, митохондриальная |
Q13011 |
30.1 |
6.9 |
+ |
–*/** |
+ |
|
22 |
Прохибитин |
P35232 |
29.8 |
5.1 |
+ |
–*/** |
+ |
|
23 |
Эндоплазматический ретикулярный белок ERp29 |
P30040 |
29.0 |
5.2 |
+ |
–*/** |
+ |
|
24 |
Аннексин A2 |
P07355 |
28.0 |
7.0 |
+ |
–*/** |
+ |
Примечание. «+» – появление белка, «–» – отсутствие белка, Mm-молекулярная масса, pI – изоэлектрическая точка, * – появление или отсутствие белков при осложненной беременности относительно физиологической статистически значимо,** – появление или отсутствие белков при ЗРП относительно преэклампсии статистически значимо.
Так, при ЗРП обнаружено снижение экспрессии белков, имеющих важное значение в регуляторных процессах. Эндоплазматический ретикулярный белок ERp29 является шапероном и ключевым фактором в фолдинге эндогенных секреторных белков. Подавление продукции этого белка может приводить к дисфункции протеасом и изменению интенсивности клеточной пролиферации [11]. Уменьшение экспрессии аннексинов А2 и А4, учитывая их роль в трансмембранном транспорте и ремоделировании цитоскелета [9, 10], очевидно, сопровождается нарушением этих процессов в плаценте. К выраженным отрицательным последствиям приводит снижение уровня прохибитина – многофункционального белка, расположенного на внутренней мембране митохондрий. Являясь шапероном этих субклеточных фракций, он регулирует в них клеточный цикл на уровне фаз G1 и S. Кроме того, прохибитин действует как транскрипционный модулятор α-рецептора эстрогена, что особенно важно для плацентарной ткани [1]. Снижение экспрессии еще двух белков, связанных с митохондриями, – цитратсинтазы и диеноил-КоА-изомеразы, в свою очередь, ухудшает работу данных клеточных структур и может сопровождаться уменьшением генерации энергии в плацентарной ткани.
Что касается актин-подобных белков 2 и 3, а также β – и γ – актинов, выполняющих различные функции в клеточных структурах, то нарушение их продукции будет сопровождаться угнетением этих функций, в частности, регуляции транспортных процессов. Снижение экспрессии кислого рибосомального белка 60S, участвующего в регулировании реакций трансляции, усугубляет метаболический дисбаланс в плаценте при ЗРП [5].
Изменение продукции белков при ЗРП проявляется не только в снижении, но и увеличении уровня некоторых из них. К числу таких белков относится α-актинин-4, связывание которого с транскрипционным фактором NF-kB, модифицирует внутриклеточные функции последнего, в том числе, усиливает экспрессию генов, запускающих апоптоз [2]. Повышенная продукция виментина и β-тропомиозина, отвечающих за сохранность структуры цитоскелета, может иметь компенсаторное значение, направленное на поддержание клеточной целостности в условиях осложненной гестации. Увеличение экспрессии молекулярного шаперона – эндоплазмина, играющего важную роль в эндоплазматическом ретикулуме при ядерной сигнализации, фолдинге и секреции ряда белков [13], по-видимому, будет отражаться на процессах, находящихся в сфере влияния данного полипептида – белковом гомеостазе и клеточной дифференцировке.
Протеомный анализ плаценты при беременности, осложнившейся преэклампсией, выявил отсутствие 6 белков. В их числе следует отметить субъединицу 2 комплекса Arp 2/3 (actin-related protein – актин-подобный белок), необходимого для поддержания сосудистого компонента плацентарной ткани, 60S кислый рибосомальный белок, 20S протеасому (α-субъединица 6-типа), ответственную за интенсивность катаболической фазы плацентарного метаболизма. Кроме того, обнаружено снижение экспрессии аннексина А4, α-тропомиозина и β-актина. Поскольку немышечные изоформы актина находятся в цитоплазматических структурах в виде микрофиламентов, участвующих в транспорте внешнего сигнала с поверхности клетки в ядро, то модификация их продукции приводит к нарушению внутриклеточного транспорта. В то же время, α-тропомиозин, комплексируясь с актиновыми филаментами, обеспечивает миграцию клеток и цитокенез [8].
Развитие преэклампсии сопровождается также появлением дополнительных белков-отличия. Выявленное повышение экспрессии митохондриальной аконитатгидратазы и пероксиредоксина-4 может играть значительную роль в изменении свободнорадикальных процессов и редокс-статуса плаценты, что является важной составляющей развития окислительного стресса, сопровождающего прогрессирование преэклампсии.
Усиленная продукция таких молекулярных шаперонов, как белок теплового шока 60 (Hsp60) и эндоплазмин, контролирующих процессы ремоделирования нативного состояния белков [5,13], возможно, имеет компенсаторный характер в поддержании корректного фолдинга ряда регуляторных белков. Появление белка 14-3-3 эпсилон, связанного с модулированием эффекторных влияний трансформирующего фактора роста-β и фактора некроза опухоли-α, может приводить к усилению апоптоза [14]. В свою очередь, повышение экспрессии проапоптозных генов может способствовать увеличению продукции ά-актинина-4, образующего мультимолекулярный комплекс с ядерным фактором NF-kB [7].
Сравнительный анализ результатов исследования плаценты при ЗРП и преэклампсии позволил обнаружить как общие изменения протеомного профиля по сравнению с таковым при физиологической беременности, так и определенные отличия.
Заключение
Таким образом, материалы настоящей работы свидетельствуют о том, что развитие осложненной беременности происходит на фоне изменения продукции белков, участвующих в регуляции апоптоза, редокс-статуса, клеточной дифференцировки и пролиферации, обладающих функциями шаперонов, трансдукторов клеточной сигнализации. Данные изменения, очевидно, имеют патогенетическое значение в формировании осложненной беременности. Различие в протеомных спектрах плаценты может определять специфику развития акушерской патологии.
Рецензенты:
Друккер Н.А., д.б.н., главный научный сотрудник отдела медико-биологических проблем в акушерстве, гинекологии и педиатрии, ФГБУ «РНИИАП» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;
Микашинович З.И., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой общей и клинической биохимии № 1 с курсом органической и неорганической химии, ГБОУ ВПО «РостГМУ» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.