Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

ROLE OF ANTI-LACTOFERRIN ACTIVITY IN THE ADHESION OF VIBRIO CHOLERAE

Korshenko V.A. 1 Cherepakhina I.Y. 1 Yakusheva O.A. 1 Alekseeva L.P. 1
1 The Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Agency for Consumer Rights Protection & Human Welfare Supervision of RF
При изучении механизма антилактоферриновой активности и ее роли в адгезии холерных вибрионов разработана методика определения ее уровня на культуре клеток аденокарциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu 80. Введены условные значения уровней адгезии. Показано, что при изучении уровня адгезии у различных биоваров и серогрупп холерных вибрионов наибольший показатель был у штаммов V. choleraeclassical. Проведено сравнительное исследование адгезивной и антилактоферриновой активностей холерных вибрионов различной эпидемической значимости. Установлено наличие выраженной коррелятивной связи между этими признаками, что указывает на их роль как в патогенезе холеры, так и в персистенции возбудителя в организме человека. Показано, что эта связь обусловлена, с одной стороны, наличием маннозочувствительных пилей адгезии, с другой – инактивирующим влиянием гемагглютинин/протеазы холерных вибрионов на лактоферрин.
While studying the anti-lactoferrin activity and its role in the adhesion of V. cholerae a new method was proposed for determination of activity level on cell culture of human duodenum carcinoma cells HuTu 80. Conventional values of adhesion levels were introduced. The study of adhesion level of V. cholerae of different biovars and serovars showed the highest value for V. cholerae classical. A comparative study was carried out of the adhesive and anti-lactoferrin activity of V. cholerae strains of different epidemic significance. Marked correlation was found between these properties indicating their role in pathogenesis of cholera and pathogen persistence in human body. It was shown that this correlation was due, on the one hand, to the presence of mannose-sensitive pili of adhesion and, on the other hand, to inactivating effect of V. cholerae hemagglutinin-protease on lactoferrin.
adhesive activity
cell culture HuTu 80
anti-lactoferrin activity
1. Balahonov S.V., Mironova L.V., Kulikalova E.S., Urbanovich L.Ja., Hunheeva Zh.Ju., Basov E.A., Afanasev M.V., Goldapel Je.G., Ganin V.S. Jepidemiologicheskij nadzor za holeroj v Sibiri i na Dalnem Vostoke: rezultaty i napravlenija sovershenstvovanija // Holera i patogennye dlja cheloveka vibriony: Rostov n/D, 2014. Vyp. 27. pp. 28–35.
2. Eroshenko G.A., Shhelkanova E.Ju. Geneticheskaja harakteristika nekotoryh shtammov Vibriocholerae ne O1/ ne O139 serogruppy, vydelennyh ot ljudej // Holera i patogennye dlja cheloveka vibriony: Rostov n/D, 2005. Vyp. 18. pp. 77–78.
3. Korshenko V.A., Cherepahina I.Ja. Rol lektinov v mehanizme realizacii antilaktoferrinovoj aktivnosti holernyh vibrionov // Pril. no. 44 k Ross. Zhur.gastrojenterologii, gepatologii, koloproktologii. Materialy Jubilejnoj Dvadcatoj Obedinennoj Rossijskoj Gastrojenterologicheskoj nedeli. M., 2014. T. XHIV. no. 5. pp. 100.
4. Podrojkina V.A., Balahnova V.V., Telesmanich N.R., Cherepahina I.Ja. Rol antilaktoferrinovoj aktivnosti v persistencii holernyh vibrionov // «ZN i SO». 2011. no. 6. pp. 46–48.
5. Toporkov A.V., Kulshan T.A., Lozovskij Ju.V., Smirnova N.I. Geneticheskaja neodnorodnost populjacii holernyh vibrionov Jel Tor, vydelennyh na territorii Astrahanskoj oblasti (1970–2002 gody) // Holera i patogennye dlja cheloveka vibriony: Rostov n/D, 2005. Vyp. 18. pp. 79–81.
6. Shhelkanova E.Ju., Eroshenko G.A., Smirnova N.I. Variabelnost uchastka hromosomy, soderzhashhego geny biosinteza O139 antigena, u razlichnyh shtammov VibriocholeraeO139 // Holera i patogennye dlja cheloveka vibriony: Rostov n/D, 2005. Vyp. 18. pp. 75–76.
7. Di Biase A.M., Tinari A., Pietrantoni A., Antonini G., Valenti P., Conte M.P. et al. Effect of bovine lactoferricin on enteropathogenic Yersinia adhesion and invasion in HEp-2 cells. J. Med. Microbiol. 2004. no. 53. pp. 407–412.
8. WillerEda M., Lima Rde L. and Giugliano L.G. In vitro adhesion and invasion inhibition of Shigella dysenteriae, Shigella flexneri and Shigella sonnei clinical strains by human milk proteins. BMC Microbiol. 2004. no. 4. pp. 18–25.

Как показали проведенные нами исследования, большинство изученных штаммов холерных вибрионов в той или иной степени обладают антилактоферриновой активностью (АЛфА), т.е. могут инактивировать белок лактоферрин [4]. Известно, что одной из функций лактоферрина является препятствие микробной адгезии и колонизации на энтероцитах кишечника человека [7, 8]. Предстояло решить вопрос – какова в этой связи роль антилактоферриновой активности в реализации холерным вибрионом одного из важнейших свойств патогенности и персистенции – адгезивной активности, т.е. выяснение роли АЛфА в патогенезе холеры и в персистенции возбудителя в организме человека.

Цель исследования: сравнить уровни адгезивной и антилактоферриновой активностей холерных вибрионов различных серогрупп и биоваров, и определить наличие или отсутствие коррелятивной связи между уровнями адгезии и АЛфА.

Материалы и методы исследования

В работе по оценке адгезивной активности использовали 20 штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы классического и Эль Тор биоваров и вибрионы 0139 серогруппы.

Для решения поставленных задач была взята культура клеток HuTu 80 (аденокарцинома двенадцатиперстной кишки человека). Культуры холерных вибрионов готовили непосредственно перед опытом. Для этого штаммы выращивали на агаре Мартена (рН 7,6–7,8) в течение 18 часов, затем засевали одну стандартную петлю (d = 2 мм) исследуемой культуры в бульон LB (рН 7,6–7,8), выдерживали в термостате при 37 °С в течение 3 часов. Все культуры с помощью денсиламетра (ErbaLachema) доводили до концентрации 108 м.к/мл. В 1 мл среды DMEM с 5 % эмбриональной бычьей сыворотки добавляли по 10 мкл стандартизованной взвеси, для получения конечной концентрации вибрионов 106 м.к./мл и вносили в пенфлаконы с дисками (диски 12,0 Х 0,11 SPL Lifesciences), на которых сформирован разреженный монослой HuTu 80. Инкубировали в течение 90 минут при 37 °С в СО2 инкубаторе (Nuare), затем удаляли питательную среду и промывали разреженный монослой дважды раствором Хенкса рН 7,4 от несвязавшихся с монослоем клеток холерных вибрионов, фиксировали 5 % формалином 1 час для соблюдения требований биологической безопасности, высушивали и окрашивали диски по Романовскому – Гимза 1:5 в течение 35–40 минут. Окрашенные диски три раза промывали раствором Хенкса рН 7,4 доставали из флаконов, высушивали, просматривали под световым микроскопом фирмы Nikon (увеличение 100×10). Просмотр дисков начинали с контроля.Адгезивные свойства определяли по числу вибрионов, связавшихся со 100 клетками HuTu 80, и рассчитывали индекс адгезии по формуле:

kor01.wmf,

где ИА – индекс адгезии;

ΣКБ – количество клеток бактерий, прикрепившихся к 100 клеткам линии HuTu 80;

100К – 100 клеток линии HuTu 80.

Оценка индекса адгезии: > 20 – высокоадгезивный штамм; от 10 до 20 – среднеадгезивный штамм; < 10 – низкоадгезивный штамм.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты определения уровня адгезии исследуемых штаммов на культуре клеток HuTu 80, представлены в табл. 1. В группе классических холерных вибрионов показатели варьировались от 16,64 ± 3,9 до 26,42 ± 6,4(среднее значение в группе 21,14 ± 4,2), т.е. были достаточно высокими. У вибрионов, относящихся к О139 серогруппе, показатели на культуре клеток HuTu 80 были очень низкими, от 4,12 ± 1,1 до 5,11 ± 1,6 (средний показатель 4,7 ± 1,2).При этом показатели были невысокими, независимо от групп штаммов (выделенных от больных и из воды открытых водоемов), примерно одинаковыми и составляли 4,6 ± 1,2 и 4,88 ± 1,3 соответственно. Причиной столь низкой активности у вибрионов О139 серогруппы может служить мощная капсула, маскирующая адгезивные рецепторы на поверхности клеток.

В группе Эль Тор вибрионов, выделенных из разных источников, показатели на клеточной модели HuTu 80 колебались от среднего до высокого (10,17 ± 4,3 – 24,46 ± 5,8). Уровень адгезии у штаммов, выделенных от больных и носителей, был достаточно высоким (18,34 ± 3,2 и 18,61 ± 5,2 соответственно), у штаммов, выделенных из воды открытых водоемов, – более низким (10,57 ± 3,6). Средний показатель в группе составил 16,34 ± 2,8.

При ранжировании штаммов вибрионов Эль Тор по эпидемической опасности (наличию генов токсинопродукции–ctxи токсинкорегулируемых пилей адгезии – tcp) результаты выглядели следующим образом (рис. 1). Наибольшим показателем обладали потенциально эпидемически опасные штаммы холерных вибрионов с генотипом ctx-tcp+ (22,39 ± 3,4) (рис. 2). Как видно, для данной группы штаммов адгезия играет важную роль для обеспечения в отсутствие токсинопродукции условий для сохранения популяции холерных вибрионов в кишечнике человека (вибриононосительство).

Таблица 1

Показатели уровня адгезии у штаммов холерных вибрионов на культуре клеток HuTu 80

Штаммы

Наличие генов

Источник

выделения

Показатели индекса адгезии

Среднее значение ИА

V. cholerae classical

437

ctx+ tcp+

Больные

26,42 ± 6,4

21,14 ± 4,2

1077

22,61 ± 4,9

971

16,64 ± 3,9

792

20,15 ± 2,6

1601

19,86 ± 3,2

V. cholerae 0139

16065

ctx+tcp+

Больные

4,12 ± 1,1

4,6 ± 1,2

4,7 ± 1,2

17258

5,11 ± 1,6

18772

ctx-tcp-

Вода открытых водоемов

5,03 ± 1,6

4,88 ± 1,3

18925

4,73 ± 1,5

V. choleraeEl Tor

18374

ctx+tcp+

Больные

16,02 ± 4,9

18,34 ± 3,2

16,34 ± 2,8

17471

15,09 ± 3,8

18775

ctx-tcp+

23,91 ± 5,4

17427

ctx+tcp+

Носители

17,03 ± 4,03

18,61 ± 5,2

18257

ctx-tcp+

20,36 ± 4,02

18821

20,83 ± 3,7

18781

24,46 ± 5,8

18750

ctx-tcp-

10,36 ± 3,9

18774

ctx-tcp-

Вода открытых водоемов

8,03 ± 3,2

10,57 ± 3,6

17899

13,51 ± 6,2

18777

10,17 ± 4,3

korhen1.wmf

Рис. 1. Показатели уровня адгезии у штаммов Эль Тор на культуре клеток HuTu 80, ранжированных по эпидемической опасности

korhen2a.tifkorhen2b.tif

Рис. 2. Адгезия на культуре клеток HuTu 80 потенциально эпидемически опасных вибрионов Эль Тор

Для эпидемически опасных штаммов с генотипом ctx+tcp+ были характерны средние значения (16,05 ± 2,2). Поскольку для этой группы штаммов основной показатель – токсинопродукция, обусловливающая клинику холеры, показатели адгезии могут быть не очень высокими. Наименьшим показателем обладали авирулентные штаммы вибрионов Эль Тор с генотипом ctx-tcp- (10,52 ± 4,1), они не продуцируют основные факторы патогенности и не персистируют в организме человека.

По полученным результатам был проведен сравнительный коррелятивный анализ между уровнем АЛфА и показателями индексов адгезии исследуемых штаммов с определением коэффициента корреляции (КК) между ними (табл. 2). Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы MicrosoftExcel 8.0 по критериям линейной регрессии и корреляции. При сравнительном анализе полученных значений обращает на себя внимание отсутствие коррелятивной связи между уровнями АЛфА и адгезии у холерных вибрионов О139 серогруппы (коэффициент корреляции отрицательный, – 0,6). У классических холерных вибрионов, обладающих высокой способностью к адгезии и низкими показателями антилактоферриновой активности, коэффициент корреляции был средним и составлял 0,76. Можно предположить, что невысокий удельный вес вибриононосительства при классической холере подтверждает вывод о низком персистентном потенциале таких вибрионов. Об этом же свидетельствует отсутствие у классических холерных вибрионов мобильных «островов персистенции» и «островов пандемичности», которые содержат гены, кодирующие продукцию факторов, обеспечивающих высокий уровень адаптации патогена к условиям окружающей среды [2, 5, 6].

Наиболее высоким был коэффициент корреляции адгезивной активности и АЛфА у вибрионов Эль Тор (0,82), при этом наиболее высок в группе потенциально эпидемически опасных штаммов ctx-tcp+ (0,99). Это свидетельствует о значимости этих признаков в персистенции возбудителя холеры, прошедшего в период седьмой пандемии холеры длительный путь эволюции в сторону повышения уровня адаптации для жизнедеятельности в различных экологических нишах.

Таблица 2

Определение коэффициентов корреляции между адгезивной и антилактоферриновой активностями у холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп

Штаммы

Значения уровня адгезии

Значения уровня АЛфА нг/мл

Наличие генов

Коэффициент корреляции (КК)

V. choleraeclassical

437

26,42 ± 6,4

40

ctx+tcp+

0,76

1077

22,61 ± 4,9

10

971

16,64 ± 3,9

0

792

20,15 ± 2,6

28

1601

19,86 ± 3,2

0

V. cholerae 0139

16065

4,12 ± 1,1

56

ctx+tcp+

– 0,6

17258

5,11 ± 1,6

24

18772

5,03 ± 1,6

55

ctx-tcp-

18925

4,73 ± 1,5

57

V. choleraeEl Tor

17427

17,03 ± 4,03

100

ctx+tcp+

0,82

0,88

17471

15,09 ± 3,8

75

18374

16,02 ± 4,9

75

18775

23,91 ± 5,4

100

ctx-tcp+

0,99

18821

20,83 ± 3,7

94

18781

24,46 ± 5,8

100

18257

20,36 ± 4,02

93

18750

10,36 ± 3,9

78

ctx-tcp-

0,67

18774

8,03 ± 3,2

40

17899

13,51 ± 6,2

75

18777

10,17 ± 4,3

79

Заключение

Проведенная работа позволила установить причину прямой коррелятивной связи между АЛфА и показателями адгезивной активности. Как известно, за адгезию и колонизацию холерных вибрионов в кишечнике человека отвечают токсинкорегулируемые пили адгезии, кодируемые генами tcpA. Кроме них известны и другие пили, в том числе, маннозочувствительные пили адгезии (MSHA), кодируемые генами mshA. В последние годы пили MSHA, считаются существенными факторами персистенции [1]. Учитывая вышеизложенное, можно предположить, что MSHA, наряду с токсинкорегулируемыми пилями, принимают участие как в адгезии холерных вибрионов, так и в связывании лактоферрина. Ранее нами было показано [3], что антилактоферриновая активность резко снижается в присутствии маннозы, которая блокирует маннозочувствительные рецепторы на поверхности холерных вибрионов. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что большинство изученных штаммов с генотипами ctx+tcp+ и ctx-tcp+ обладали генами mshA, кодирующими маннозочувствительные пили адгезии.

Несомненна и роль гемагглютинин/протеазы, расщепляющей лактоферрин и препятствующей тем самым адгезии этого белка на эпителиоцитах кишечника (ген hapA обнаружен у всех взятых в опыт штаммов холерных вибрионов). Таким образом, можно констатировать, что выраженная коррелятивная связь антилактоферриновой и адгезивной активностей является подтверждением важности этих двух признаков в патогенезе холеры и персистенции холерных вибрионов Эль Тор в организме человека.

Рецензенты:

Терентьев А.Н., д.м.н., с.н.с., ведущий научный сотрудник лаборатории диагностики ООИ, г. Ростов-на-Дону;

Кудрякова Т.А., д.м.н., с.н.с., ведущий научный сотрудник лаборатории бактериофагов ООИ, г. Ростов-на-Дону.