Высокая частота возникновения хронического травматического остеомиелита и неудовлетворительные результаты его лечения закономерно повышают теоретический и практический интерес к изучению патогенетических механизмов развития воспалительного процесса при переломах [2, 5, 8].
Доказано, что к одним из основных факторов, определяющих особенности исхода при переломах, относится иммунная система, нарушение которой может приводить к развитию воспалительных осложнений [5, 10]. Иммунные клетки секретируют многочисленные медиаторы (цитокины), играющие ключевую роль в развитии воспалительного ответа [3].
Одним из таких медиаторов является полипептидный цитокин – TNF-α, выполняющий регуляторные и эффекторные функции в иммунном ответе и воспалении. Этот цитокин входит в группу провоспалительных цитокинов и выполняет важнейшие функции в период запуска воспаления [3]. Согласно исследованиям последних лет, важная роль в развитии осложнений отводится наследственным факторам. Генетически запрограммированный повышенный или пониженный синтез цитокинов является существенным в предрасположенности к инфицированию, развитию заболевания и длительному, осложнённому течению [1, 9].
Ген TNFα – высокополиморфный участок генома, в котором описано по меньшей мере восемь полиморфных сайтов. Некоторые из полиморфизмов оказывают влияние на уровень продукции TNF-α in vitro. Многие исследования показали ассоциацию отдельных полиморфизмов промотора гена TNFα-308G > A с различными аутоиммунными и инфекционными заболеваниями [11, 13, 14, 15].
Поскольку в нашей стране и за рубежом молекулярно-генетическим исследованиям больных травматолого-ортопедического профиля не уделено должного внимания, изучение генетического полиморфизма цитокинов, принимающих участие в механизмах регуляции межклеточных взаимодействий у больных при травме, а также поиски генетических маркеров развития осложнений представляются весьма перспективными.
Цель исследования – изучить влияние полиморфизма гена TNFα-308G > A на экспрессию TNFα у больных с развитием хронического травматического остеомиелита в Забайкальском крае.
Материалы и методы исследования
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2011 – поправки) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утверждёнными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Проведено обследование 132 пациентов в возрасте от 20 до 40 лет с переломами длинных костей конечностей, лечившихся в травматологических стационарах г. Читы. Первую группу составили 83 больных с неосложнённым течением переломов (группа клинического сравнения), вторую группу – 49 больных с осложнённым течением (в данной группе отмечалось заживление ран первичным натяжением, однако в позднем послеоперационном периоде зарегистрировано развитие хронического травматического остеомиелита). Контрольную группу составили 100 практически здоровых мужчин и женщин в возрасте от 20 до 40 лет.
Всем пациентам с закрытыми переломами проводилась открытая репозиция отломков с последующим металлоостеосинтезом пластинами или штифтами. Больным с открытыми переломами при поступлении выполнялась первичная хирургическая обработка и наложение аппаратов наружной фиксации. В дальнейшем применялась традиционная консервативная терапия (антибактериальные средства, дезагреганты, местное медикаментозное лечение и др.). Сформированные группы являлись относительно однородными как по возрасту, полу, характеру и локализации переломов, так и по проводимому лечению. Критерием исключения из групп являлось наличие острых или хронических сопутствующих заболеваний.
Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Для исследования выбрана точковая мутация TNFα в позиции 308 (G > A). Амплификацию фрагмента исследуемого гена проводили в термоцикле (модель Ре «Бис» – М111 (ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы праймеров научно-производственной фирмы «Литех»-«SNP» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия в проходящем в ультрафиолетовом свете [6].
Определение концентрации цитокина TNF-α осуществляли с помощью набора реагентов ООО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).
Сроки наблюдения за больными составили: при поступлении в стационар (1 сутки после травмы), 2, 5, 10 сутки после оперативного лечения, в дальнейшем через 3 месяца.
Полученные данные обработаны с помощью пакета программ «STATISTICA 6.1» (Stat Soft, USA), «Microsoft Office Exell 2010 for Windows 7», «БИОСТАТ». Для описания характера распределения количественных признаков определялись средние величины (М), стандартные отклонения (SD). Анализ данных между группами пациентов в разные сроки посттравматического периода проводили с помощью критерия Ньюмена – Кейлса. Для сравнения показателей пациентов с осложнённым и неосложнённым течением переломов длинных костей конечностей использовали критерий Манна – Уитни. Для анализа групп по качественному бинарному признаку применялся критерий χ2. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Первым этапом нами выявлена частота распределения аллелей и генотипов полиморфного гена TNFα-308G > A в исследуемых группах (табл. 1 и 2).
Отмечено, что в группе с хроническим травматическим остеомиелитом на долю гомозиготного генотипа –308G/G гена TNFα приходилось 12,2 %, тогда как в группе с неосложнённым течением – 73,5 %. Гетерозиготный генотип –308G/A гена TNFα встречался в 42,9 % у пациентов второй группы против 26,5 % в первой. В группе с развитием хронического травматического остеомиелита выявлено 22 (44,9 %) пациента с гомозиготной мутацией. Частота аллели –308G– гена TNFα у больных группы с неосложнённым течением переломов составила 0,87, –308А– аллели – 0,13, а в группе с хроническим травматическим остеомиелитом – 0,34 и 0,66 соответственно (р < 0,001). Таким образом, анализ полиморфизма гена TNFα-308G > A у пациентов с неосложнённым течением переломов длинных костей и развитием хронического травматического остеомиелита в позднем периоде травмы выявил достоверные различия по частотам распределения аллелей и генотипов.
Вторым этапом исследования мы определили содержание провоспалительного цитокина TNF-α в исследуемых группах (табл. 3). Установлено, что уровень TNF-α в первые сутки после травмы повышался в сравнении с контролем и оставался неизменным на 2 сутки после операции. К 5 суткам после оперативного вмешательства параметры TNF-α снижались по сопоставлению с 2 сутками после операции и на 10 сутки не отличались от контрольных значений. На 90 сутки послеоперационного периода только в группе с развитием травматического остеомиелита концентрация исследуемого показателя превышала аналогичные параметры группы контроля и клинического сравнения (табл. 3).
Таблица 1
Частота генотипов гена TNFα-308G > A и его аллельных вариантов среди здоровых резидентов и пациентов с неосложненным и осложненным (травматический остеомиелит) течением переломов длинных костей конечностей (χ2, df = 1)
|
Контроль, n = 100 |
Неосложненное течение, n = 83 |
Хронический остеомиелит, n = 49 |
|
|
Аллель G OR [95 % CI] |
0,825 |
0,867 1,39 [0,78–2,48] |
0,333 0,11 [0,06–0,19] |
|
Аллель A OR [95 % CI] χ2 р |
0,175 |
0,133 0,72 [0,4–1,28] 1,24 0,26 |
0,663 9,29 [5,33–16,18] 70,33 0,0001 |
|
Генотип GG OR [95 % CI] |
0,71 |
0,735 1,13 [0,59–2,17] |
0,122 0,06 [0,02–0,15] |
|
Генотип GA OR [95 % CI] |
0,23 |
0,265 1,21 [0,62–2,37] |
0,429 2,51 [1,21–5,23] |
|
Генотип AA OR [95 % CI] χ2 р |
0,06 |
0,00 0,09 [0,0–1,57] 5,25 0,07 |
0,449 12,77 [4,7–34,67] 52,84 0,0001 |
Примечание. р – статистическая значимость различий с контролем.
Таблица 2
Частота аллельных вариантов гена TNFα-308G > A и его генотипов среди пациентов с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей и развитием хронического травматического остеомиелита (χ2, df = 1)
|
Неосложненное течение (n = 83) |
Хронический остеомиелит (n = 49) |
χ2 |
р |
OR [95 % CI] |
|
|
Аллель G |
0,867 |
0,337 |
78,56 |
0,0001 |
0,08 [0,04–0,14] |
|
Аллель A |
0,133 |
0,663 |
12,89 [6,98–23,82] |
||
|
Генотип GG |
0,735 |
0,122 |
62,57 |
0,0001 |
0,05 [0,02–0,13] |
|
Генотип GA |
0,265 |
0,429 |
2,08 [0,99–4,39] |
||
|
Генотип AA |
0 |
0,449 |
136,6 [8,02–232,8] |
Примечание. р – статистическая значимость различий между группами.
Таблица 3
Содержание TNF-α в крови больных с переломами длинных костей, пг/мл (М ± SD)
|
Показатель |
Контроль (n = 100) |
Дни исследования |
|||||
|
При поступлении |
2 сутки после операции |
5 сутки после операции |
10 сутки после операции |
90 сутки после операции |
|||
|
I группа (n = 83) |
TNF-α р р1 р2 р3 р4 |
25 ± 16,32 |
49,5 ± 26,6 0,0001 |
53,3 ± 19,9 0,0001 > 0,05 |
41,1 ± 21,2 0,0001 > 0,05 < 0,05 |
28,3 ± 20,6 0,5 < 0,05 < 0,05 < 0,05 |
26,2 ± 16,2 0,7 < 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05 |
|
II группа (n = 49) |
TNF-α р р1 р2 р3 р4 |
49,3 ± 26,0 0,0001 |
54,6 ± 20,3 0,0001 > 0,05 |
42,1 ± 21,8 0,0001 > 0,05 > 0,05 |
29,5 ± 20,4 0,34 < 0,05 < 0,05 > 0,05 |
130 ± 51,5* 0,0001 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 |
|
Примечания: р – статистическая значимость различий с контролем; р1 – статистическая значимость различий с 1 сутками после травмы; р2 – статистическая значимость различий со 2 сутками после операции; р3 – статистическая значимость различий с 5 сутками после операции; р4 – статистическая значимость различий с 10 сутками после операции; * – статистическая значимость различий соответствующего показателя пациентов с неосложнённым течением переломов.
Таблица 4
Содержание TNFα в крови больных с неосложнённым течением переломов в зависимости от генотипа полиморфизма гена TNFα–308G > A, пг/мл (М ± SD)
|
Группы |
Дни наблюдения |
||||
|
при поступлении |
2 сутки после операции |
5 сутки после операции |
10 сутки после операции |
90 сутки после операции |
|
|
Генотип G/G |
|||||
|
Контроль (n = 71) |
8,34 ± 5,66 |
||||
|
Группа с неосложнённым течением (n = 61) |
19,77 ± 8,9 р = 0,0001 |
23,19 ± 8,36 p = 0,0001 р1 < 0,05 |
17,03 ± 9,14 p = 0,0001 р1 < 0,05 р2 < 0,05 |
10,17 ± 6,02 p = 0,074 р1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 |
9,62 ± 5,5 p = 0,19 р1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 р4 > 0,05 |
|
Генотип G/A |
|||||
|
Контроль (n = 23) |
27,53 ± 6,41 р5 = 0,0001 |
||||
|
Группа с неосложнённым течением (n = 22) |
44,27 ± 9,32 p = 0,0001 p5 = 0,0001 |
52,46 ± 9,84 p = 0,0001 p1 < 0,05 p5 = 0,0001 |
39,87 ± 9,92 p = 0,0001 p1 < 0,05 р2 > 0,05 p5 = 0,0001 |
30,05 ± 9,31 p = 0,29 p1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 р5 = 0,0001 |
29,2 ± 7,96 p = 0,44 p1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 p4 > 0,05 р5 = 0,0001 |
|
Генотип A/A |
|||||
|
Контроль (n = 6) |
9,15 ± 7,61 |
||||
|
Группа с неосложнённым течением (n = 0) |
– |
– |
– |
– |
– |
Примечания: р – статистическая значимость различий с контролем; р1 – статистическая значимость различий при поступлении; р2 – статистическая значимость различий со 2 сутками после операции; р3 – статистическая значимость различий с 5 сутками после операции; р4 – статистическая значимость различий с 10 сутками после операции; р5 – статистическая значимость различий по сравнению с гомозиготами G/G.
Следующим этапом работы мы определили влияние генотипов полиморфизма гена TNFα-308G > A на уровень продукции кодируемого цитокина (табл. 4, 5).
Уровень провоспалительного цитокина TNF-α как у травмированных, так и здоровых лиц значимо различается в зависимости от носительства генотипов гена TNFα. Так, при носительстве генотипа –308G/G у пациентов I и II групп при поступлении, а также в группе контроля, концентрация цитокина TNF-α регистрировалась соответственно в 2,2, 2,2 и 3,3 раза ниже по сравнению с носителями генотипа –308G/A (р < 0,0001). В контрольной группе и у пациентов с осложненным течением травматической болезни при носительстве генотипа –308GА/A зафиксировано увеличение уровня TNF-α соответственно в 1,4 и 1,9 раза по сопоставлению с генотипом –308G/A (р < 0,0001). Аналогичная картина экспрессии TNFα в зависимости от выявляемого генотипа зарегистрирована во все последующие дни исследования (табл. 5).
Таким образом, полученные результаты показывают, что наличие генотипа –308А/А полиморфизма гена TNFα способствует более высокой экспрессии цитокина TNF-α, что согласуется с данными литературы [4, 7]. Однако, функциональная значимость полиморфизма гена TNFA-308G > A в работах разных исследователей неоднозначна, что, по-видимому, обусловлено природой патогенеза заболевания, особенностями клеточных линий, стимуляторов и другими условиями эксперимента [12, 14, 16].
Таблица 5
Содержание TNFα в крови больных с развившимся травматическим остеомиелитом в зависимости от генотипа полиморфизма гена TNFα-308G > A, пг/мл (М ± SD)
|
Группы |
Дни наблюдения |
||||
|
при поступлении |
2 сутки после операции |
5 сутки после операции |
10 сутки после операции |
90 сутки после операции |
|
|
Генотип G/G |
|||||
|
Контроль (n = 71) |
8,34 ± 5,66 |
||||
|
Группа с развившимся остеомиелитом (n = 6) |
20,58 ± 5,84 p = 0,0001 |
24,69 ± 6,17 p = 0,0001 р1 > 0,05 |
18,15 ± 9,45 p = 0,0001 р1 > 0,05 p2 > 0,05 |
14,6 ± 7,34 p = 0,0001 р1 > 0,05 р2 > 0,05 р3 > 0,05 |
51,67 ± 16,1 p = 0,0001 р1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 р4 < 0,05 |
|
Генотип G/A |
|||||
|
Контроль (n = 23) |
27,53 ± 6,41 р5 = 0,0001 |
||||
|
Группа с развившимся остеомиелитом (n = 21) |
45,03 ± 8,73 p = 0,0001 p5 = 0,0001 |
54,78 ± 10,91 p = 0,0001 p1 < 0,05 p5 = 0,0001 |
41,42 ± 12,0 p = 0,0001 p1 > 0,05 р2 < 0,05 p5 = 0,0001 |
39,5 ± 9,06* p = 0,0001 p1 > 0,05 р2 < 0,05 р3 > 0,05 p5 = 0,0001 |
131,7 ± 23,2* p = 0,0001 p1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 p4 < 0,05 р5 = 0,0001 |
|
Генотип A/A |
|||||
|
Контроль (n = 6) |
39,15 ± 7,61 р5 = 0,0001 р6 = 0,0001 |
||||
|
Группа с развившимся остеомиелитом (n = 22) |
84,44 ± 13,84 p = 0,0001 p5 = 0,0001 p6 = 0,0001 |
76,82 ± 9,84 p = 0,0001 p1 > 0,05 p5 = 0,0001 p6 = 0,0001 |
66,84 ± 11,38 p = 0,0001 p1 < 0,05 р2 > 0,05 p5 = 0,0001 p6 = 0,0001 |
59,07 ± 11,09 p = 0,0001 p1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 > 0,05 p5 = 0,0001 p6 = 0,0001 |
184,1 ± 37,2 p = 0,0001 p1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 p4 < 0,05 р5 = 0,0001 p6 = 0,0001 |
Примечания: р – статистическая значимость различий с контролем; р1 – статистическая значимость различий при поступлении; р2 – статистическая значимость различий со 2 сутками после операции; р3 – статистическая значимость различий с 5 сутками после операции; р4 – статистическая значимость различий с 10 сутками после операции; р5 – статистическая значимость различий по сравнению с гомозиготами G/G; р6 – статистическая значимость различий по сравнению с гетерозиготами G/А; * – статистическая значимость различий с неосложнённым течением переломов.
У пациентов с хроническим травматическим остеомиелитом наиболее часто встречается гетерозиготный генотип мутаций, что повышает вероятность развития воспалительных осложнений при переломах длинных костей конечностей, а при выявлении гомозиготной мутации гена TNFα-308G > А отмечено более тяжелое и длительное течение раневой инфекции, что согласуется с данными литературы и подтверждает возможную ассоциативную связь между повышенной частотой аллеля TNFα-308А и тяжелым течением гнойно-воспалительных заболеваний. Данный факт указывает на важный вклад аллельного полиморфизма генов цитокинов в индивидуальные различия больных по характеру течения инфекционного процесса и эффективности механизмов протективного иммунитета вследствие разной экспрессии кодируемого цитокина [3, 4, 6].
Выводы
1. У больных с развитием травматического остеомиелита регистрируется более высокое носительство генотипов –308G/A, –308A/A гена TNFα.
2. Наличие генотипа –308А/А полиморфизма гена TNFα у больных с переломами длинных костей конечностей способствует более высокой экспрессии провоспалительного цитокина TNF-α.
Рецензенты:
Цыбиков Н.Н., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита;
Намоконов Е.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой общей и специализированной хирургии с курсом топографической анатомии и оперативной хирургии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита.