Распространенность воспалительных заболеваний пародонта среди взрослого и детского населения Российской Федерации остается довольно высокой, несмотря на большое количество научных исследований и методов лечения [1, 2]. Одним из ведущих факторов в этиологии и патогенезе заболеваний пародонта является микробная флора полости рта. Согласно современным представлениям, бактериальная агрессия, являясь одним из инициальных факторов в развитии заболеваний пародонта, вызывает различные формы поражения пародонтального комплекса [3–5]. Полученные данные о роли анаэробной и смешанной бактериальной флоры в развитии заболеваний пародонта позволили выделить группу так называемых пародонтопатогенных бактерий. Ротовая жидкость содержит в своем составе различные биологически активные соединения – ферменты, пептиды, метаболиты, гормоны, иммуноглобулины [6–8]. Изменение состава ротовой жидкости происходит при развитии кариозного процесса, а также при гингивите и различных формах пародонтита, что сопровождается в свою очередь изменением активности ферментов ротовой жидкости. Оценка подобной активности с использованием биохимических методов поможет более точно оценить степень поражения пародонта и более полно мониторировать процесс лечения.
Материалы и методы исследования
Клинические методы исследования
Клинические данные регистрировали в разработанные нами формализованные истории болезни. При клиническом осмотре отмечали зубную формулу, состояние слизистой оболочки полости рта, наличие некариозных поражений, мягкий зубной налет, над- и поддесневые зубные отложения, наличие или отсутствие аномалий зубов и прикуса.
Для объективной оценки гигиенического состояния полости рта и тканей пародонта в процессе наблюдения использовали следующий тест, пародонтальный индекс (ПИ).
Индекс ПИ необходим для выявления степени выраженности воспалительно-деструктивных изменений в тканях пародонта. Оценивают состояние пародонта у каждого зуба: 0 – нет воспаления, 1 – легкий гингивит, воспаление не окружает весь зуб, 2 – гингивит, воспаление полностью окружает зуб, но повреждения прикрепленного эпителия нет, 6 – гингивит с образованием патологического зубо-десневого кармана, прикрепленный эпителий поврежден, жевательная функция зуба не нарушена, зуб неподвижен, 8 – выраженная деструкция тканей пародонта с потерей жевательной функции, зуб легко подвижен, может быть смещен.
Интерпретация индекса: 0,1–1,5 – начальная, I стадия пародонтита, 1,5–4,0 – II стадия, 4,0–8,0 – III стадия.
Определение активности ферментов в ротовой жидкости: щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы и a-амилазы
Объектом исследования являлась нестимулированная ротовая жидкость, полученная путем сплевывания. Собранная ротовая жидкость в количестве 2 мл использовалась для определения активности и кинетических параметров ферментов – лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и амилазы.
В работе использовали набор жидких реагентов, готовых к определению активности щелочной фосфатазы, ЛДГ и a-амилазы в ротовой жидкости. Производитель ЗАО «Диакон».
Данная часть исследования проводилась с помощью готового набора химических реагентов и биохимического анализатора «Hospitex», Швейцария. Для получения разведений образцов ротовой жидкости использовали бидистиллированную воду.
Щелочную фосфатазу определяли по методу W. Kubler, 1973. Щелочная фосфатаза катализирует реакцию гидролиза нитрофенилфосфата с образованием эквимолярного количества нитрофенола и фосфата. Скорость образования нитрофенола прямо пропорциональна активности щелочной фосфатазы и измеряется фотометрически при длине волны 405 нм.
Амилазу определяли по методу В.А. Ткачук и соавт., 2002. Использовали колориметрический ферментативный анализ. Субстратом является 4,6-этилен-нитрофенил-мальтогептозид. Метод основан на полной переработке всех нитрофенилолигомальтозидов – продуктов амилазной активности Анализ дает суммарную амилазную активность (все изоферменты).
Активность лактатдегидрогеназы определяли по методу D. Weissar, 1975. Принципом определения активности лактатдегидрогеназы является ультрафиолетовый метод. Пируват превращается в лактат с одновременным окислением НАДН. Скорость уменьшения экстинкции при 340 нм, связанная с окислением НАДН, прямо пропорциональна активности ЛДГ в пробе.
Определение скорости и константы Михаэлиса – Ментен ферментативной реакции
Скорость реакции определяется как количество вещества, превращенного (образовавшегося или распавшегося) в единицу времени. Она является функцией концентраций участвующих в реакции веществ, которые непрерывно меняются по мере протекания реакции. Поэтому однозначное определение скорости реакции может быть дано только в случае если конечное изменение количества вещества в единицу времени заменить на дифференциальную разность, относящуюся к бесконечно малому времени dt. Количество превращенных веществ обычно выражают в виде изменения объемной концентрации с.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенного исследования обнаружены изменения активности ферментов (амилаза, ЩФ, ЛДГ) ротовой жидкости у пациентов с пародонтитом различной степени, в исследованиях in vitro установлено снижение активности амилазы на фоне увеличения активности ферментов ЛДГ и ЩФ (табл. 1, рис. 1).
При разработке прогностического коэффициента активности ЛДГ/амилаза и оценке его значения для диагностики пародонтита на различных его стадиях следует обратить внимание на то, что концентрация ионов водорода будет находиться в прямой зависимости от активности ЛДГ (в процессе метаболизма глюкозы происходит увеличение концентрации лактата в ротовой жидкости), в то время как активность амилазы слюны будет находиться в обратной зависимости от концентрации ионов водорода и снижается при уменьшении значений рН меньше 6,8. Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) данный показатель составляет 2,83 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 3,30 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 4,85 и на 3 стадии пародонтита 6,10 безразмерных единиц активности. Увеличение индекса активности ЛДГ/амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 2,2 раза.
Кроме показателя ЛДГ/амилаза можно использовать и показатель ЩФ/амилаза, так как активность ЩФ будет в большей степени определяться количеством бактериальных клеток в ротовой жидкости и, следовательно, процессы закисления среды также будут обратно пропорционально коррелировать с активностью амилазы слюны. Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) данный показатель составляет 0,32 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 0,38 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 0,52 и на 3 стадии пародонтита – 0,66 безразмерных единиц активности.
Увеличение индекса активности ЩФ/амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 2 раза.
Таблица 1
Изменение активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и при пародонтитах различной степени тяжести (in vitro) (ЕД/л)
|
Амилаза M ± m |
ЛДГ M ± m |
ЩФ M ± m |
|
|
Интактный пародонт |
68 ± 2,3 |
193,0 ± 7,3 |
22 ± 1,3 |
|
Пародонтит 1 степени |
63 ± 3,1 |
207,2 ± 8,2 * |
24 ± 1,2 |
|
Пародонтит 2 степени |
48 ± 3,5** |
233,0 ± 8,8** |
25 ± 1,7* |
|
Пародонтит 3 степени |
41 ± 2,0** |
250,6 ± 11,6** |
27 ± 1,2** |
Примечание. * – достоверность при сравнении активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом в сравнении с активностью ферментов при пародонтитах различной степени тяжести р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.
Рис. 1. Изменение активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом в сравнении с активностью ферментов при пародонтитах различной степени тяжести (in vitro)
Таким образом, для диагностики степени воспалительного процесса можно использовать соотношение активности ферментов ЛДГ и амилазы, а также ЩФ и амилазы.
Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) показатель скорости биохимической реакции для индекса ЛДГ/амилаза составляет 2,2 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 3,40 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 5,3 и на 3 стадии пародонтита 7,0 безразмерных единиц активности. Увеличение индекса скорости биохимической реакции ЛДГ\амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 3 раза.
Кроме показателя ЛДГ\амилаза можно использовать и показатель ЩФ/амилаза, так как активность ЩФ будет в большей степени определяться количеством бактериальных клеток в ротовой жидкости и, следовательно, процессы закисления среды также будут обратно пропорционально коррелировать с активностью амилазы слюны. Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) данный показатель составляет 1,3 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 2,7 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 4,0 и на 3 стадии пародонтита 5,0 безразмерных единиц активности.
Увеличение индекса скорости биохимической реакции ЩФ\амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 4 раза.
Таким образом, для диагностики степени воспалительного процесса можно использовать соотношение скоростей реакций ферментов ЛДГ и амилазы, а также ЩФ и амилазы.
Таблица 2
Изменение скорости биохимической реакции ферментов ротовой жидкости с интактным пародонтом и пародонтитом различной степени тяжести in vitro (М/л∙с)
|
Амилаза M ± m |
ЛДГ M ± m |
ЩФ M ± m |
|
|
Интактный пародонт |
24 ± 2,2 |
53 ± 4,5 |
32 ± 2,4 |
|
Пародонтит 1 степени |
22 ± 1,2 |
74 ± 6,5** |
58 ± 3,3** |
|
Пародонтит 2 степени |
18 ± 1,4* |
96 ± 5,4** |
74 ± 5,4** |
|
Пародонтит 3 степени |
16 ± 1,1** |
110 ± 7,3** |
81 ± 4,2** |
Примечание. * – достоверность при сравнении скорости реакции ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.
Рис. 2. Изменение скорости биохимической реакции ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом в сравнении со скоростью ферментов при пародонтитах различной степени тяжести (in vitro)
Проведенные исследования показали, что в контроле (при интактном пародонте) показатель – константа Михаэлиса – составляет 0,24 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 0,30 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 0,40 и на 3 стадии пародонтита 0,43 безразмерных единиц активности. Увеличение индекса для константы Михаэлиса ЛДГ/амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 2 раза.
Кроме показателя ЛДГ\амилаза можно использовать и показатель ЩФ/амилаза, так как активность ЩФ будет в большей степени определяться количеством бактериальных клеток в ротовой жидкости и, следовательно, процессы закисления среды также будут обратно пропорционально коррелировать с активностью амилазы слюны. Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) данный показатель составляет 0,46 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 0,52 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 0,72 и на 3 стадии пародонтита 0,88 безразмерных единиц активности.
Увеличение индекса для константы Михаэлиса ЩФ/амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит примерно в 2 раза.
Таблица 3
Изменение константы Михаэлиса (Km) ферментов ротовой жидкости с интактным пародонтом и у больных пародонтитом с различной степенью тяжести in vitro (⋅10–3 М)
|
Амилаза M ± m |
ЛДГ M ± m |
ЩФ M ± m |
|
|
Интактный пародонт |
5,8 ± 0,2 |
1,4 ± 0,04 |
2,7 ± 0,03 |
|
Пародонтит 1 степени |
6,1 ± 0,1 |
1,8 ± 0,03* |
3,2 ± 0,02* |
|
Пародонтит 2 степени |
6,5 ± 0,3* |
2,6 ± 0,04** |
4,8 ± 0,03** |
|
Пародонтит 3 степени |
6,7 ± 0,4** |
2,9 ± 0,05** |
5,9 ± 0,05** |
Примечание. * – достоверность при сравнении скорости реакции ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.
Рис. 3. Изменение константы Михаэлиса ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом в сравнении с константой Михаэлиса ферментов при пародонтитах различной степени тяжести (in vitro)
Заключение
В исследованиях in vitro установлено снижение активности амилазы на фоне увеличения активности ферментов ЛДГ и ЩФ. Для диагностики степени воспалительного процесса предложено использовать соотношение активности, скорости ферментативной реакции и изменение величины константы Михаэлиса для ферментов ЛДГ\амилаза и ЩФ\амилаза. Использование индексов ферментов в диагностике стадий пародонтита позволит более точно прогнозировать развитие патологического процесса в пародонте и назначить своевременное лечение этого заболевания.
Рецензенты:
Гладилин Г.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики ФПК и ППС, ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Саратов;
Коршунов Г.В., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований ГБУ «СарНИИТО» Минздрава России, г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 24.11.2014.