Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

Лапина Г.П., Лихуша П.С.

Ферменты полифенолоксидазной группы важны: участвуют в клеточном дыхании и являются основной терминальной оксидазой у растений. В настоящее время фермент о-дифенолоксидаза (о-ДФО) растительного происхождения мало изучен, поэтому определение физико-химических и ферментативных свойств данного фермента необходимо и значимо для выяснения его роли в процессах лигнификации льна на молекулярном уровне, что позволит найти новые подходы к улучшению качества льняных волокон. В данной работе изучена о-дифенолоксидаза проростков льна-долгунца.

Цели и задачи, поставленные в данной работе:

  • выделить о-ДФО из проростков льна;
  • рассчитать содержание фермента;
  • изучить ферментативные параметры о-ДФО биотканей льна при варьировании ионной силой раствора.

Фермент о-ДФО выделяли из проросших семян льна во фракции суммарных белков в соответствии с методикой, предложенной В.Д. Анисимовым, Т.Б. Кастальевой, с собственными модификациями. В надосадочной жидкости - о - дифенолоксидаза. Для дальнейшего исследования определили концентрацию о-ДФО с использованием калибровочного кривой. Содержание фермента рассчитано и составило 7,5·10-3 г/г сырой массы биотканей льна, что коррелирует с данными литературы. Ферментативные параметры о-ДФО (константа Михаэлиса kM и константа каталитическая kкат) рассчитывали с использованием метода Бояркина по начальным участкам кинетических кривых Д - t, перестроенных в координатах двойных обратных величин - координатах Лайнуивера-Берка, при варьировании концентрации ее субстратов: пероксида водорода и бензидина. Ионную силу (I) раствора создавали хлоридом натрия и меняли в интервале 0,1 - 0,4 М.

На основе полученных экспериментальных данных, рассчитанные ферментативные параметры о - ДФО льна составили:

I =0,1 M: kM = 0,09 ·10- 3 моль/л kкат = 7,7 с -1;

I = 0,2 M: kМ = 0,13·10- 3 моль/л, kкат = 27,7 с -1;

I = 0,3 M: kМ = 4,13·10- 3 моль/л, kкат = 424,9 с -1;

I = 0,4 M: kМ = 0,15·10- 3 моль/л, kкат = 22,6 с -1

При повышении ионной силы до 0,3 М одновременно увеличивается значение и kМ, и kкат. Далее при снижении ионной силы до 0,4 М наблюдается снижение значений и kМ, и kкат.

Примем состояние системы с ионной силой 0,1 М за исходное состояние. Тогда при:

а) I = 0,2 M значения kМ 0,2 > kМ 0,1 и Vmax0.1 < Vmax0.2

этот случай по классификации Крупянко (1999) описывается как Ia - тип эффектирования фермента, названный двухпараметрически согласованной активацией;

б) I = 0,3 M значения Km0,1 < Km0,3 и Vmax0.1 < Vmax0.3

Ионная сила, равная 0,3 М, вызывает ингибирование фермента, который описывается как Vi -тип эффектирования о-ДФО льна, названный псевдоингибированием;

в) I = 0,4 M значения Km0,4 > Km0,1 и Vmax0.4 > Vmax0.1

Согласно классификации Крупянко (1999) это соответствует IIi -типу, а именно, двухпараметрически рассогласованному ингибированию биокатализатора.

Итак, влияние ионной силы раствора специфично разнонаправлено действует на течение ферментативного процесса, а именно, сопровождается сменой типов эффектирования (Vi → Ia → IIi): ингибирование о-дифенолоксидазы льна, выявленное при ионной силе, равной 0,2 М, сменяется активацией фермента с возрастанием ионной силы до 0,3 М. При дальнейшем повышении ионной силы раствора до 0,4 М вновь наблюдается ингибирование биокатализатора. Кроме того, в каждом конкретном случае меняется и тип эффектирования ферментативной реакции.

Привлечение метода диаграммных построений в двумерной K´mV´ - системе координат позволило получить визуализацию регулирования ферментативным поведением о-ДФО льна при возрастании ионной силы раствора, а также рассчитать дополнительные ферментативные характеристики: длины соответствующих векторов и провести конкретизацию каталитических свойств о-ДФО льна при изменении ионной силы раствора: с повышением ионной силы раствора установлено изменение механизма течения ферментативной реакции и её интенсивности.