Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Дофаминергическая система вовлечена в патогенез многих психоневрологических заболеваний (эпилепсия, шизофрения, депрессия, наркомания и др.). При этом показано, что в формируемых при этих заболеваниях дисфункциях дофаминергической системы ведущую роль играют нарушения функционирования дофаминовых рецепторов второго типа (D2) [7].

Известны две изоформы этого рецептора (длинная – D2L и короткая – D2S) [9]. Исследованиями по молекулярной генетике человека показано, что экспрессия D2S снижена у носителей генотипа А1А1 локуса Taq 1 A DRD2 [15]. Так как DRD2 у крысы на 95 % гомологичен с этим геном человека (10), можно полагать, что выявленная закономерность имеет место и у крыс. Известно, что снижение экспрессии D2S и изменение в силу этого соотношения длинной и короткой изоформ приводит к повышению синтеза и выделения дофамина (ДА), что предопределяет повышение его содержания в тканях мозга [6, 12].

Целью работы явилось выявление особенностей поведения у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) и предопределяющих их факторов путем анализа морфофункциональных характеристик миндалевидного комплекса мозга (МК).

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на двух группах половозрелых гомозиготных крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа с массой тела 250–320 г. Две субпопуляции крыс линии WAG/Rij впервые получены на кафедре МФЧЖ БашГУ путем скрещивания гомозиготных особей, выявленных генетическим анализом указанного локуса в исходной популяции этих крыс [3]. Генетический анализ полиморфного локуса Taq 1 A DRD2 у крыс линии WAG/Rij был выполнен под руководством заведующего отделом геномики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН профессора Э.К. Хуснутдиновой.

Всех использованных в работе половозрелых крыс содержали в стандартных условиях вивария, характеризующихся постоянством комнатной температуры (20–22 °С) и уровнем влажности. Пищу и питьё животные получали ad libitum, продолжительность светового дня составляла 12–14 часов. Все процедуры с животными выполняли с соблюдением международных правил и норм (Eropean Communities Council Directives,1986).

Ориентировочно-исследовательское поведение крыс в условиях новизны обстановки изучали в установке «открытое поле». Оно представляло собой квадратную освещенную в центре арену (лампой 40 Вт) площадью 100 см2, разделенную на 16 равных частей. Регистрировали показатели горизонтальной и вертикальной активности, определяли количество эпизодов и время, затрачиваемое крысой на груминг (чесательный рефлекс), пребывание в состоянии неподвижности и латентный период до пересечения первого квадрата (амбуляции). Вегетативные реакции крыс регистрировали на основании учета числа уринаций и болюсов.

Цитоархитектонические и морфометрические характеристики структур МК изучены на фронтальных срезах мозга толщиной 20 мкм, которые окрашивали по методу Ниссля. Для определения относительной массы мозга использованы данные, полученные при измерениях массы тела и мозга 224 крыс [112 крыс (равное количество самцов и самок) в каждой группе]. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии определяли содержание дофамина в МК и его группировках у двух изучаемых групп крыс линии WAG/Rij, имеющих разные генотипы. Материал для исследования брали от 3–4 крыс, умерщвленных передозировкой эфирного наркоза. После декапитации извлекали из черепа головной мозг и с помощью специальных устройств из нативного мозга на льду выделяли МК [1] и отдельно кортикомедиальную и базолатеральную группировки [2]. Образцы, взятые из правого и левого полушария головного мозга крыс, использовали для приготовления супернатантов, которые анализировали на высокоэффективном жидкостном хроматографе (Аквилон, Россия) со спектрофотометрическим детектором (UVV-104 M).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0. Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия U-критерий Манна – Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Они показали, что популяция крыс (самцы + самки) с генотипом А1/А1 DRD2 характеризуется большей двигательной активностью (p < 0,001), более интенсивной исследовательской деятельностью (p < 0,001), большим количеством эпизодов и длительностью груминга (p < 0,001, p < 0,01 соответственно), меньшей выраженностью иммобилизации (p < 0,01) и незначительным числом уринаций (p < 0,01) по сравнению с крысами с генотипом А2/А2.

Эти данные свидетельствуют, что между двумя группами крыс существуют значимые различия по всем изученным параметрам, регистрируемым в установке «открытое поле». Крысы с генотипом А1/А1 DRD2, активно перемещающиеся и интенсивно исследующие новую среду, демонстрируют активную, а крысы с генотипом А2/А2 DRD2 – пассивную стратегию поведения.

Поскольку дофамин рассматривается как первичное звено поведенческой активности [13], т.к. служит важнейшим медиатором в структурах мозга, участвующих в организации ориентировочно-исследовательского поведения, среди которых ведущее место занимает миндалевидный комплекс (МК) – было решено определить, каково содержание ДА в МК у двух популяций изучаемых нами крыс. Его результаты показали, что в МК крыс с генотипом А1/А1 содержится практически вдвое больше (на 75 %, p < 0,05) ДА по сравнению с крысами, имеющими генотип А2/А2. Это подтвердило мнение нейрофизиологов о том, что ДА причастен к активному типу поведения [4].

Выяснено, что D2S локализуется пресинаптически и представляет собой ауторецептор, в то время как длинная изоформа (D2L) преимущественно располагается на постсинаптическом компоненте [8, 12]. Активация D2S нарушает синтез и выделение ДА, ограничивая эти процессы, и приводит к снижению двигательной активности, в то время как активация D2L повышает локомоторную активность [5].

Приведенные сведения объясняют особенности поведения крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2. У крыс с генотипом А1/А1 снижение экспрессии D2S ведет к повышению синтеза и выделения ДА из пресинаптической терминали дофаминергического синапса, проявлением чего является гиперактивность. У крыс с генотипом А2/А2, исходя из выявленных нами особенностей поведения, можно предполагать изменение экспрессии D2L в пользу D2S, что и является основой их гиподинамии и сниженного содержания дофамина. Высказанное предположение подтверждается результатами работы Wang et al. [14], которые исследовали поведение D2L-/- мышей. Авторы показали, что D2L-/- мыши (у которых сохранялась экспрессия только D2S, и она была повышена) по сравнению с контролем демонстрировали в установке «открытое поле» снижение двигательной активности и исследовательской деятельности.

Полученные результаты выявили ассоциацию генотипа А1/А1 по локусу Taq 1 A DRD2 с гиперактивностью в «открытом поле» и с повышенным содержанием ДА в мозге экспериментальных животных, в то время как генотип А2/А2 по этому локусу проявлял себя противоположными характеристиками – меньшей двигательной активностью и менее интенсивной исследовательской деятельностью.

Выявившиеся различия в поведении двух групп крыс линии WAG/Rij указали на необходимость анализа структурно-количественных характеристик МК как ведущего центра мозга в организации поведенческих реакций животных.

Исследование общей структурной организации заднего отдела МК позволило установить, что его конструкция у них тождественна. Проведенный цитоархитектонический анализ заднего отдела у крыс линии WAG/Rij c генотипами А1/А1 и А2/А2 и сравнение полученных данных с крысами линии Вистар показал, что по общей структурной организации отклонений у крыс с разными генотипами по локусу Taq 1 A DRD2 между собой и с крысами линии Вистар не существует. В составе заднего отдела есть все ядерные центры, формации палеокортекса, а также присутствует межуточная формация – заднее кортикальное ядро.

Для получения более точных сведений мы провели структурно-количественный анализ. Он показал, что удельная площадь МК не различается у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2. Сравнение удельных площадей двух основных группировок структур МК – кортикомедиальной и базолатеральной – у крыс с разными генотипами обнаружило, что существуют высоко значимые различия по величине удельной площади базолатеральной группировки. Удельная площадь базолатеральной группировки значимо больше у крыс с генотипом А2/А2 (p < 0,001) по сравнению с крысами с генотипом А1/А1.

Не связана ли большая площадь базолатеральной группировки у крыс с генотипом А2/А2 с большей массой мозга? Для ответа на этот вопрос мы провели сравнительный анализ величин массы тела и головного мозга, а также рассчитали относительную массу мозга (ОММ – масса мозга в мг разделена на массу тела, г) у двух изучаемых нами групп крыс с разными генотипами (таблица).

Удельная площадь МК, группировок ее структур и показатели массы тела, головного мозга и относительной массы мозга (ОММ) у крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2 (M + m, проценты)

Примечание: ***p < 0,001 при сравнении базолатеральной группировки у крыс с разными генотипами.

Анализ величин массы тела, головного мозга и относительной массы мозга (ОММ – масса мозга в мг разделена на массу тела, г) у двух изучаемых нами групп крыс показал, что масса тела крыс с генотипом А1/А1 значимо больше (p < 0,001), в то время как масса головного мозга и ОММ больше у крыс с генотипом А2/А2 (p < 0,001). Таким образом, крысы с генотипом А2/А2 имеют большую массу мозга и ОММ, что коррелирует с наличием большей площади базолатеральной группировки МК.

Выводы

1. анализ ориентировочно-исследовательского поведения двух групп крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1 A DRD2 выявил ассоциацию генотипа А1/А1 с активной, генотипа А2/А2 – пассивной стратегией поведения;
2. результаты морфометрического анализа МК показали, что его площадь не различается у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2, но у крыс с генотипом А2/А2 существуют высоко значимое увеличение удельной площади базолатеральной группировки структур МК и большая относительная масса головного мозга;
3. хроматографический анализ ткани МК и его группировок показал, что в МК крыс с генотипом А1/А1 содержится больше дофамина по сравнению с крысами, имеющими генотип А2/А2.

Работа выполнена при финансовой поддержке базовой части Госзадания Минобрнауки РФ, тема № 301-14.

Рецензенты:

Хисматуллина З.Р., д.б.н., профессор, зав. кафедрой физиологии человека и зоологии Башкирского государственного университета, г. Уфа;

Башкатов С.А., д.б.н., профессор кафедры генетики и фундаментальной медицины Башкирского государственного университета, г. Уфа.

Работа поступила в редакцию 10.07.2014.