Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Стремительное ухудшение здоровья населения за последние 20 лет в большой степени обусловлено первичными и вторичными иммунодефицитными состояниями (ИДС) [2–4]. Наиболее часто ИДС проявляются в настоящее время вялотекущими хроническими воспалительными процессами, обусловленными персистенцией инфекционных агентов вирусной природы [1]. В связи с этим научный интерес представляют оппортунистические инфекции, вызываемые цитомегаловирусом (ЦМВ) и вирусом Эпштейна – Барр [1, 5, 7]. Кроме роста серопозитивности населения к этим инфекциям актуальность данной проблемы связана со сложностью диагностики и лечения данных инфекций [5, 8]. Вопрос о клинических проявлениях и иммунных сдвигах, возникающих при ЦМВИ и ВЭБИ, до настоящего времени является дискуссионным [7, 9, 10].

Цель исследования – изучение клинико-иммунологических аспектов инфекций, вызванных ВЭБ и ЦМВ, для оптимизации диагностики и лечения больных с данной патологией.

Материалы и методы исследования

В исследование были включены пациенты с верифицированной цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВИ) и инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна – Барр (ВЭБИ). В 1 группу вошли 295 человек (243 женщины и 52 мужчины, средний возраст 32,5 ± 0,6 лет) с активным течением ЦМВИ; во 2 группу – 120 пациентов (95 женщин и 25 мужчин, средний возраст 32,4 ± 0,8 лет) с активным течением ВЭБИ. Свидетельством активного течения ЦМВИ являлась регистрация ДНК вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или «ранних белков» возбудителя с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ), специфических IgМ методом иммуноферментного анализа, антител IgМ к отдельным белкам ЦМВ методом Western-blot (наборы фирмы «Euroimmun») или Line-blot (фирма «Microgen», Германия), низкоавидных специфических антител IgG, а также наличию IgG к ранним белкам вируса методом иммуноблотинга. Серологические маркеры ЦМВ выявляли в сыворотке крови пациентов с помощью тест-систем ЗАО «Вектор Бест» (Новосибирск): «ВектоЦМВ-IgM-стрип» – для выявления иммуноглобулинов класса IgM к ЦМВ, «ВектоЦМВ-IgG-стрип» – для выявления иммуноглобулинов класса IgG к ЦМВ. Постановку полимеразной цепной реакции осуществляли с помощью тест-систем производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва): «АмплиСенс® Цитомегаловирус-500/ВКО-800» и «АмплиСенс® EBV-EPh». РИФ осуществляли при помощи набора «ЦМВ МоноСкан» (НПФ «Лабдиагностика», Москва). Активное течение ВЭБИ подтверждалось выявлением ДНК вируса, специфических IgМ, ЕА-IgG и IgА. Для ПЦР-метода использовали наборы «АмплиСенс» с детекцией по конечной точке (ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии», г. Москва). IgМ и IgG к ВЭБ определяли на тест-системах ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирская обл.), IgА – на наборах компании «Euroimmun AG» (Германия). Иммуноблот (Western-blot) проводился на тест-системах производства «Euroimmun AG» и «Immunodiagnostik» (Германия). Основным материалом для исследования служили: кровь, соскобы со слизистой рта и миндалин, из цервикального канала. Исследование клеточного звена иммунитета включало определение относительного и абсолютного количества CD3⁺ -, CD4⁺ -, CD8⁺ -, CD16⁺ -, CD20⁺ -, CD25⁺ -, CD95⁺ -, HLA-DR⁺ -лимфоцитов методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител («Beckman Coulter») на проточном цитометре Cytomics FC 500 («Beckman Coulter», США). Определение IgG, IgМ, IgА осуществлялось турбодиметрическим методом. Пролиферативная способность лимфоцитов оценивалась в реакции бласттрансформации при добавлении в культуральную среду фитогемагглютинина (ФГА, Difco, США) в концентрации 10 мкг/мл и без него (спонтанный и стимулированный варианты). Кроме того, оценивали показатели фагоцитоза, кислородный метаболизм нейтрофилов в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте. Активность комплемента определялась методом 50 % гемолиза. Уровень циркулирующих иммунных комплексов определяли общепринятыми методами (по Хашковой и Дижону). Статистическая обработка осуществлялась с помощью программы «STATISTICA 6.0» с использованием параметрических и непараметрических методов: Т-критерия Стьюдента, метода углового преобразования Фишера (Рφ), критерия Манна – Уитни (U). Различия величин считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Локализация и частота выделения ЦМВ методом РИФ у обследованных пациентов представлена следующим образом: зев (в 42,2 % случаев), уретра (21,6 %), полость рта (12,9 %), цервикальный канал (8,6 %), очаг поражения (6,9 %), кровь (2,6 %), глаза и нос (по 1,7 %), шейка матки и кожа (по 0,9 %). При положительном результате ПЦР в 46 % случаев ЦМВ выявлялся в уретре и цервикальном канале, в 23,1 % – в вагине, в 15,4 % – в крови, в 7,7 % – в зеве. Таким образом, с помощью РИФ цитомегаловирус чаще выявлялся в зеве и уретре, а с помощью ПЦР анализа – в уретре, цервикальном канале и вагине.

Для установления активности ВЭБИ у пациентов 2 группы чаще использовался ИФА (антитела IgМ и ранние ЕА-IgG выявлены в 42 % случаев) и иммуноблот. Методом Western-blot выявлены антитела к ранним белкам вируса у 43 (36 %) человек. ДНК вируса с помощью ПЦР-метода выделен у 32 пациентов (26,7 %), причем у 18 человек из зева и у 8 – в крови. Методом РИФ ВЭБ был обнаружен в 2-х случаях в крови, у 1 пациента – в зеве и в 1-м случае – в цервикальном канале. С помощью двух методов – ПЦР и Western-blot выявлено активное течение ВЭБИ у 7 человек, а ПЦР и ИФА – у 3 человек. С помощью РИФ ВЭБ чаще выявлялся в крови, зеве и цервикальном канале, а с помощью ПЦР анализа – в зеве, полости рта и уретре. У обследованных больных в анамнезе отмечались хронический тонзиллит и тонзиллофарингит (в 1 группе – 34,9 %, во 2 группе – в 25,8 % случаев), частые ОРВИ (17,9 и 17,5 % случаев соответственно), субфебрилитет (53,3 и 58,3 %), астения (44,7 и 49,2 %), лимфоаденопатия (13,1 и 10,0 %), дисбактериоз (9,3 и 10,0 % пациентов) и артралгия (6,4 и 10,8 %). Таким образом, у пациентов с ЦМВИ и ВЭБИ не выявлено патогномоничных симптомов, характерных для каждой из рассматриваемых инфекций, за исключением тонзиллита, который статистически значимо чаще регистрировался при ЦМВИ (р = 0,04). Из сопутствующих воспалительных заболеваний у обследованных пациентов преобладала урогенитальная патология (19,6 и 19,2 % случаев в 1 и 2 группах) и другая, кроме тонзиллофарингита, патология ЛОР-органов (ринит, гайморит и отит) – у 13 % больных 1 группы и 10 % больных 2 группы, а также имели место бронхит и конъюнктивит. Чаще сопутствующие бактериальные инфекции наблюдались у пациентов 2 группы в сравнении с больными 1 группы (у 65 и 40,5 % больных соответственно; р < 0,001). Инфекции, вызванные атипичными микроорганизмами, регистрировались у пациентов 1 и 2 групп со следующей частотой: хламидиоз – 23,2 и 24,2 % случаев соответственно, микоплазмоз – 18,7 и 27,5 % (р = 0,026), уреаплазмоз – 10,2 и 7,5 %. Грибковые инфекции в 1 и 2 группах отмечались с частотой 12,3 и 28,3 % и чаще наблюдались у пациентов с ВЭБИ (р < 0,001). При этом 28,0 % женщин 1 группы и 24,2 % пациенток 2 группы страдали вагинальным кандидозом. Установлена одинаковая частота регистрации пиодермии у пациентов с ЦМВИ (9,5 %) и с ВЭБИ (10,0 %). Фурункулез статистически значимо чаще регистрировался у пациентов 2 группы в сравнении с больными 1 группы (21,7 и 12,8 % случаев соответственно; р = 0,013). При выявлении частоты встречаемости других иммунопатологических синдромов установлена статистически значимо более частая регистрация аутоиммунного синдрома у больных 2 группы (11,8 и 24,2 %; р < 0,001).

Наиболее часто сопутствующая соматическая патология наблюдалась со стороны желудочно-кишечного тракта: у пациентов 1 группы в 29,4 %, 2 группы – в 24,2 % случаев. Гинекологические заболевания отмечены у 45 и 55 % женщин 1 и 2 групп соответственно (р = 0,033). Эрозия шейки матки имела место у 32,3 и 38,9 % женщин 1 и 2 групп соответственно. Осложненный акушерский анамнез (ОАА) регистрировался чаще у женщин с ЦМВИ (28,8 и 18,9 % соответственно в 1 и 2 группах; р = 0,017).

Установленным фактом считается, что оппортунистические инфекции, к которым относятся ЦМВИ и ВЭБИ, манифестно протекают у больных с вторичными иммунодефицитами. Поэтому большое внимание уделяется изучению иммунного профиля данных больных. Оценка типа иммунодефицита показала преобладание изолированно клеточного (31,5 % в 1 группе и 43,9 % больных во 2 группе) и клеточно-фагоцитарного (36,4 и 17,3 % пациентов соответственно в 1 и во 2 группах). У 12,3 % пациентов 1 группы и 9,4 % больных 2 группы определялся изолированно-фагоцитарный тип иммунодефицита.

По данным лабораторного иммунологического обследования пациентов обеих групп выявлено наличие инфекционного синдрома вирусного генеза: лейкоцитоз – 7,83 ± 0,9·109/л; 6,6 ± 0,23·109/л соответственно в 1 и 2 группах; относительный и абсолютный лимфоцитоз (41,3 ± 1,9 % и 2,3 ± 0,06·109/л – в 1 группе; 38,3 ± 0,85 % и 2,4 ± 0,15·109/л – во 2 группе). При анализе содержания субпопуляций лимфоцитов у больных 1 и 2 групп обращали на себя внимание следующие моменты (табл. 1).

Таблица 1

Показатели клеточного звена иммунитета (M ± m) больных

Примечания: * – различия статистически значимы (р < 0,05) при сравнении показателей больных ЦМВИ и в контроле; ** – различия статистически значимы при сравнении показателей больных ВЭБИ и в контроле; *** – различия статистически значимы при сравнении показателей больных ЦМВИ и ВЭБИ.

У пациентов 1 группы в сравнении с контролем снижена доля CD3⁺-, CD4⁺-, CD20⁺-, CD25⁺-, HLA-DR⁺-лимфоцитов, абсолютное количество CD16⁺-, CD20⁺- и HLA-DR⁺-лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс, спонтанная и индуцированная бласттрансформация лимфоцитов, повышены - асолютное содержание CD8⁺-лимфоцитов и CD95⁺-лимфоцитов. У пациентов 2 группы в сравнении с контролем снижены доля CD3⁺-, CD4⁺-, CD16⁺-, CD25⁺- и HLA-DR⁺-лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс, спонтанная и индуцированная бласттрансформация лимфоцитов, повышены - абсолютное содержание CD4⁺-, CD95⁺- и HLA-DR⁺-лимфоцитов. У больных ВЭБИ в сравнении с пациентами с ЦМВИ статистически значимо выше доля и абсолютное количество CD3⁺-лимфоцитов, абсолютное количество CD4⁺-лимфоцитов, абсолютное количество CD95⁺- и HLA-DR⁺-лимфоцитов, ниже доля CD25⁺-лимфоцитов. Имеются сведения о том, что CD4⁺-клетки способны играть центральную роль в контроле рецидивов инфекции [1]. Полученные данные свидетельствуют о снижении доли этих клеток у пациентов 1 и 2 групп и абсолютного количества у пациентов с ЦМВИ в сравнении с донорами. У пациентов обеих групп по сравнению с контролем снижена доля лимфоидных клеток, экспрессирующих маркеры ранней (CD25⁺) и поздней (HLA-DR⁺) активации лимфоцитов, что свидетельствует об угнетении эффекторной фазы цитотоксического иммунного ответа.

Установлено, что ВЭБ нарушает механизмы иммунного ответа, подавляет продукцию интерферонов, блокирует механизмы апоптоза, вызывает при присоединении к мембране В-лимфоцита экспрессию особого антигена, распознающегося как чужеродный, что способствует формированию аутоиммунных процессов [6]. Нами выявлено повышение у пациентов обеих групп и особенно у больных с ВЭБИ абсолютного количества лимфоцитов, экспрессирующих рецептор CD95 (р < 0,05). ВЭБ индуцирует, с одной стороны, дефект преимущественно клеточного звена иммунитета, с другой - нарушает готовность к апоптозу инфицированных клеток, что приводит к формированию хронического процесса [6].

При исследовании фагоцитарного и гуморального звеньев иммунитета (табл. 2) установлено, что у пациентов 1 группы в сравнении с контролем снижены фагоцитарное число, фагоцитарный индекс, индекс завершенности фагоцитоза, повышены НСТ-спонтанный и уровень основных классов иммуноглобулинов. У пациентов 2 группы в сравнении с контролем так же, как у пациентов 1 группы снижены показатели фагоцитоза нейтрофилов, НСТ-индуцированный, повышены уровни Ig G и Ig A. У пациентов 1 группы в сравнении с пациентами 2 группы ниже показатели фагоцитарной активности нейтрофилов, но выше спонтанная активация нейтрофилов (р < 0,05). Это, в свою очередь, свидетельствует о снижении функционального резерва микрофагов. У больных с ЦМВИ в сравнении с пациентами с ВЭБИ статистически значимо выше уровень IgМ.

Таблица 2

Показатели фагоцитарного и гуморального звеньев иммунитета (M ± m) больных

Примечания: * – различия статистически значимы (р < 0,05) при сравнении показателей больных ЦМВИ и в контроле; ** – различия статистически значимы при сравнении показателей больных ВЭБИ и в контроле; *** – различия статистически значимы при сравнении показателей больных ЦМВИ и ВЭБИ.

Следует отметить высокий уровень ЦИК у пациентов обеих групп, особенно у больных с ВЭБИ.

Заключение

Таким образом, у пациентов с ЦМВИ и ВЭБИ не выявлено патогномоничных симптомов, характерных для каждой из рассматриваемых инфекций, за исключением тонзиллита, который статистически значимо чаще регистрировался при ЦМВИ. Сопутствующие бактериальные инфекции, фурункулез, грибковые инфекции, а также аутоиммунный синдром чаще наблюдались у пациентов с ВЭБИ. Осложненный акушерский анамнез регистрировался чаще у женщин с ЦМВИ. У пациентов обеих групп по сравнению с контролем снижена доля лимфоидных клеток, экспрессирующих маркеры ранней (CD25⁺) и поздней (HLA-DR⁺) активации лимфоцитов, что свидетельствует об угнетении эффекторной фазы цитотоксического иммунного ответа. У больных с ВЭБИ в сравнении с пациентами с ЦМВИ статистически значимо выше доля и абсолютное количество CD3⁺-лимфоцитов, абсолютное количество CD4⁺-, CD95⁺- и HLA-DR⁺-лимфоцитов, ниже доля CD25⁺-лимфоцитов. У пациентов с ЦМВИ в сравнении с пациентами с ВЭБИ ниже показатели фагоцитарной активности нейтрофилов, но выше спонтанная активация нейтрофилов и уровень IgМ.

Рецензенты:

Ляпин В.А., д.м.н., профессор кафедры анатомии, физиологии, спортивной медицины и гигиены, ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный университет физической культуры и спорта», г. Омск;

Корягина Ю.В., д.б.н., профессор кафедры анатомии, физиологии, спортивной медицины и гигиены, ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный университет физической культуры и спорта», г. Омск.

Работа поступила в редакцию 10.07.2014.