Побочным эффектом неоадъювантной химиотерапии при раке молочной железы (РМЖ) является развитие иммуносупрессии, что преодолевается назначением препаратов, способных активировать иммунную систему и тем самым повысить защитные механизмы организма опухоленосителя [3, 7–8]. Известно, что препараты нуклеиновых кислот, применяемые в терапии пациентов с онкологической патологией, способствуют активации как факторов неспецифической защиты организма (нейтрофилы, макрофаги, натуральные киллерные клетки), так и факторов специфической защиты организма (Т- и В-лимфоциты, дендритные клетки).
Поэтому целью исследования стало изучение влияния полихимиотерапии на параметры иммунной системы in vivo на фоне лечения фрагментированной ДНК из плаценты человека у крыс линии Wistar с РМЖ, индуцированной введением метилнитрозомочевины.
Материалы и методы исследования
Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и с соблюдением принципов Хельсинкской декларации BMA (2000). Эксперимент выполнен на 25 крысах-самках линии Wistar с массой 300–350 г. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. РМЖ у 21 крысы линии Wistar индуцировали введением N-метил-N-нитрозомочевины (Sigma-Aldrich, США) 5 раз с интервалом в 7 дней подкожно в область одной и той же молочной железы (2-я молочная железа справа) [9]. Было сформировано 6 групп животных: 1-я группа – интактные особи (n = 4); 2-я группа – животным проведено только оперативное удаление пораженной молочной железы (n = 3); 3-я группа – животным проведено оперативное удаление пораженной молочной железы, подключена полихимиотерапия и введение фрагментированной ДНК (n = 5); 4-я группа – животным проведено оперативное удаление опухоли и проводилась полихимиотерапия (n = 5); 5-я группа – животным не удалялась опухоль молочной железы, но проводилась полихимиотерапия (n = 4). 6-ю группу составили животные, которым индуцировали РМЖ (опухоленосители), но не проводилось хирургическое вмешательство и полихимиотерапия (n = 4). Курс полихимиотерапии (ПХТ) включал в себя: 5-фторурацил (Ebewe, Австрия) из расчета 15 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии; метотрексат (Ebewe, Австрия) из расчета 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии; циклофосфан (ОАО «Биохимия», Саранск) из расчета 3 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно однократно 14 дней. Курс терапии фрагментированной ДНК (5 мг/кг) проводили внутрибрюшинным введением однократно в течение 14 дней через 3 часа после введения циклофосфана. В экспериментах использовали субстанцию препарата Панаген с содержанием фрагментированной ДНК 1,7 мг/мл. Препарат Панаген (ЛСР № 004429/08 от 09.06.08) представляет собой фрагментированный нуклеопротеидный комплекс, выделенный из плаценты человека. Оперативное лечение проводили через 6 месяцев от момента индукции РМЖ. Животных из эксперимента выводили через 6 месяцев под наркозом (40 мг/кг нембутана внутрибрюшинно; Sigma-Aldrich, США), что обусловливалось необходимостью прижизненного сбора лимфы из грудного лимфатического протока. Ядросодержащие клетки костного мозга (КМ) получали при помощи перфузии бедренных костей лабораторных животных [2]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) от линии крыс Wistar (n = 5) получали из клеток КМ. Ядросодержащие клетки КМ ресуспендировали в среде DMEM (Биолот, СПб) и пропускали через фильтр (размер пор 80 мкм) для удаления клеточного дебриса, подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Для получения КМ-ММСК ядросодержащие клетки КМ инкубировали в пластиковых флаконах (TPP, Швейцария) в среде DMEM (Биолот, СПб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина сульфата (Дальхимфарм, Хабаровск), 2 мM L-глютамина (ICN, США) и 15 % FCS при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Через 48 часов неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а прилипающую фракцию клеток культивировали до получения конфлюэнтного слоя. Снятие КМ-ММСК при пассировании осуществляли с использованием 0,25 % раствора трипсина/0,02 % раствора ЭДТА (ICN, США). Суспензию спленоцитов получали измельчением селезенок от лабораторных животных [2]. Мононуклеарные клетки (МНК) из лимфы получали осаждением при 1500 об/мин в течение 5 минут с последующей 2-кратной отмывкой в ЗФР. Пролиферативный потенциал клеток КМ, спленоцитов и МНК из лимф оценивали в МТТ-тесте в присутствии и отсутствии Конканавалина А (Sigma-Aldrich, США) в дозе 10 мкг/мл оценивали спектрофотометрически (длина волны 492 нм) по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида – МТТ (Sigma-Aldrich, США) через 72 часа и выражали в условных единицах оптической плотности. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна – Уитни и принималась при значениях p < 0,05 [1].
Результаты исследований и их обсуждение
Представлялось важным изучить, как влияет включение экзогенной ДНК к неоадъювантной химиотерапии на функциональную активность клеток гемо- и лимфопоэза. Так, отмечено статистически значимое увеличение спонтанной пролиферативной активности МНК из лимфы в группах крыс, подвергшихся оперативному вмешательству и ПХТ, в группе, получавшей лечение фрагментированной ДНК, и в группе опухоленосителей, по сравнению с интактными животными (табл. 1). Интенсивность пролиферативного потенциала МНК в ответ на митогенный стимул была сопоставимой во всех группах, за исключением группы, подвергшейся оперативному вмешательству и дополненной ПХТ. Интегральный показатель пролиферации, выражаемый в индексе стимуляции, выявил, что его значение статистически значимо выше по сравнению с группой животных, получавших терапию фрагментированной ДНК, и группой сравнения по РМЖ.
Анализ пролиферативной активности клеток КМ в группах животных с РМЖ выявил статистически значимые различия как в спонтанном, так и митоген-стимулированном тесте (табл. 2). Так, наивысшая спонтанная пролиферативная активность отмечена в группе крыс, подвергшихся только оперативному вмешательству, и в группе опухоленосителей. В остальных экспериментальных группах спонтанный пролиферативный потенциал клеток КМ был статистически значимо ниже по сравнению с интактными животными. Аналогичная картина наблюдается и для пролиферативной активности клеток КМ при стимуляции митогеном. Клетки КМ крыс из группы, подвергшейся только удалению молочной железы, имели статистически значимо высокую пролиферацию в ответ на дополнительную стимуляцию их Конканавалином А. В то же время в остальных экспериментальных группах пролиферативный потенциал клеток КМ был статистически значимо меньшим по сравнению с аналогичным показателем для интактных животных.
Как видно из табл. 3, спонтанная пролиферативная активность спленоцитов животных из опытных групп была статистически значимо выше по сравнению с аналогичным параметром в интактной группе. Уровень спонтанной пролиферации в группе, получавшей лечение фрагментированной ДНК, был статистически значимо меньшим по сравнению с другими опытными группами, особенно с группой опухоленосителей. Аналогичная картина характерна и для пролиферативной активности спленоцитов, индуцированной митогенным стимулом.
Таблица 1
Показатели пролиферативной активности мононуклеаров из грудного лимфатического протока крыс-самок линии Wistar (Me; Lq-Hq)
|
Параметры |
Спонтанный уровень пролиферации |
Конканавалин А-индуцированный уровень пролиферации |
Индекс стимуляции |
|
Интактные (1) |
0,192; 0,162-0,215 p1-3 = 0,049 p1-4 = 0,020 p1-6 = 0,043 |
0,240; 0,189-0,281 p1-4 = 0,021 |
1,25; 1,10-1,40 p1-3 = 0,049 p1-6 = 0,043 |
|
Прооперированные без ПХТ (2) |
0,226; 0,212-0,294 p2-4 = 0,034 |
0,301; 0,251-0,312 p2-4 = 0,034 |
1,11; 1,06-1,42 |
|
Прооперированные ПХТ + ДНК (3) |
0,267; 0,263-0,309 |
0,257; 0,210-0,326 p3-4 = 0,027 |
0,96; 0,80-1,05 |
|
Прооперированные + ПХТ (4) |
0,354; 0,347-0,380 p4-5 = 0,021 p4-6 = 0,021 |
0,413; 0,355-0,456 p4-6 = 0,043 |
1,10; 1,02-1,20 |
|
ПХТ без оперативного лечения (5) |
0,215; 0,204-0,278 |
0,300; 0,197-0,405 |
1,13; 0,93-1,61 |
|
Опухоленосители (6) |
0,304; 0,257-0,316 |
0,235; 0,205-0,304 |
0,92; 0,73-1,05 |
Примечание. МНК - мононуклеарные клетки; ПХТ - полихимиотерапия; фрДНК - фрагментированная ДНК из плаценты человека; p - достоверность различий.
Таблица 2
Показатели пролиферативной активности клеток костного мозга крыс-самок линии Wistar (Me; Lq-Hq)
|
Исследуемые параметры |
Спонтанный уровень пролиферации |
Конканавалин А-индуцированный уровень пролиферации |
Индекс стимуляции |
|
Интактные (1) |
0,359; 0,349-0,359 p1-2 = 0,034 p1-3 = 0,014 p1-4 = 0,021 p1-5 = 0,021 p1-6 = 0,021 |
0,651; 0,646-0,656 p1-2 = 0,034 p1-3 = 0,014 p1-4 = 0,021 p1-5 = 0,021 p1-6 = 0,021 |
1,82; 1,81-1,86 p1-2 = 0,034 p1-3 = 0,014 p1-4 = 0,021 p1-5 = 0,021 p1-6 = 0,021 |
|
Прооперированные без ПХТ (2) |
0,456; 0,450-0,4604 p2-3 = 0,025 p2-4 = 0,034 p2-5 = 0,034 p2-6 = 0,034 |
0,799; 0,790-0,810 p2-3 = 0,025 p2-4 = 0,034 p2-5 = 0,034 p2-6 = 0,034 |
1,75; 1,71-1,80 p2-3 = 0,025 p2-4 = 0,034 p2-5 = 0,034 p2-6 = 0,034 |
|
Прооперированные ПХТ + ДНК (3) |
0,232; 0,230-0,232 p3-4 = 0,014 p3-5 = 0,014 p3-6 = 0,014 |
0,437; 0,430-0,437 p3-4 = 0,014 p3-5 = 0,014 p3-6 = 0,014 |
1,88; 1,86-1,88 p3-4 = 0,014 p3-5 = 0,014 p3-6 = 0,014 |
|
Прооперированные + ПХТ (4) |
0,133; 0,131-0,136 p4-5 = 0,021 p4-6 = 0,021 |
0,272; 0,267-0,285 p4-5 = 0,021 p4-6 = 0,021 |
2,05; 2,03-2,08 p4-5 = 0,021 p4-6 = 0,021 |
|
ПХТ без оперативного лечения (5) |
0,309; 0,304-0,314 p5-6 = 0,021 |
0,283; 0,274-0,293 p5-6 = 0,021 |
0,91; 0,87-0,96 p5-6 = 0,021 |
|
Опухоленосители (6) |
0,369; 0,364-0,374 |
0,563; 0,558-0,568 |
1,53; 1,50-1,54 |
Примечание. МНК – мононуклеарные клетки; ПХТ – полихимиотерапия; фрДНК – фрагментированная ДНК из плаценты человека; p – достоверность различий.
Таким образом, анализ функциональной активности клеток гемо- и лимфопоэза по данным пролиферативного потенциала как в спонтанном, так и митоген-стимулированном тесте выявил, что не во всех случаях терапия животных фрагментированной ДНК способствовала активации пролиферации клеток гемо- и лимфопоэза.
Таблица 3
Показатели пролиферативной активности спленоцитов крыс-самок линии Wistar (Me; Lq-Hq)
|
Параметры |
Спонтанный уровень пролиферации |
Конканавалин А-индуцированный уровень пролиферации |
Индекс стимуляции |
|
Интактные (1) |
0,083; 0,070-0,107 p1-2 = 0,034 p1-3 = 0,014 p1-4 = 0,021 p1-5 = 0,021 p1-6 = 0,021 |
0,063; 0,057-0,074 p1-2 = 0,034 p1-3 = 0,014 p1-4 = 0,021 p1-5 = 0,021 p1-6 = 0,021 |
0,76; 0,69-0,81 p1-2 = 0,034 p1-3 = 0,014 p1-5 = 0,021 p1-6 = 0,021 |
|
Прооперированные без ПХТ (2) |
0,400; 0,397-0,417 p2-3 = 0,025 p2-4 = 0,034 p2-5 = 0,034 p2-6 = 0,034 |
0,420; 0,410-0,431 p2-3 = 0,025 p2-4 = 0,034 p2-5 = 0,034 p2-6 = 0,034 |
1,03; 1,03-1,03 p2-3 = 0,025 p2-4 = 0,034 p2-5 = 0,034 p2-6 = 0,034 |
|
Прооперированные ПХТ + ДНК (3) |
0,170; 0,160-0,170 p3-4 = 0,014 p3-5 = 0,014 p3-6 = 0,014 |
0,148; 0,148-0,150 p3-4 = 0,014 p3-6 = 0,014 |
0,87; 0,87-0,88 p3-4 = 0,014 p3-5 = 0,014 p3-6 = 0,027 |
|
Прооперированные + ПХТ (4) |
0,252; 0,247-0,265 p4-5 = 0,021 p4-6 = 0,021 |
0,179; 0,172-0,189 p4-6 = 0,021 |
0,70; 0,65-0,76 p4-5 = 0,021 p4-6 = 0,021 |
|
ПХТ без оперативного лечения (5) |
0,363; 0,359-0,374 p5-6 = 0,021 |
0,160; 0,152-0,170 p5-6 = 0,021 |
0,43; 0,40-0,47 p5-6 = 0,021 |
|
Опухоленосители (6) |
0,790; 0,780-0,795 |
0,651; 0,649-0,656 |
0,82; 0,82-0,83 |
Примечание. МНК – мононуклеарные клетки; ПХТ – полихимиотерапия; фрДНК – фрагментированная ДНК из плаценты человека; p – достоверность различий.
Полученные результаты по количественному составу органов кроветворения и лимфопоэза также не противоречат литературным данным о нормализации состава периферической крови после введения цитостатических препаратов [5]. Так, нами через 2 недели после окончания курса ПХТ экспериментальным животным при РМЖ не выявлено статистически значимых различий по количеству мононуклеарных клеток в лимфе грудного протока между всеми группами животных, что указывает на тот факт, что органы гемопоэза преодолели повреждающее действие цитостатиков. Более того, транзиторная лимфопения, возникающая на фоне терапии цитостатиками, способствует появлению в организме нового пула лимфоцитов, способных эффективно оказывать цитотоксический эффект на клетки опухоли [4]. Более того, полученные данные о восстановлении пула мононуклеарных клеток в лимфе, в том числе и на фоне терапии экзогенной ДНК, согласуются с данными авторов, указывающих на стимуляцию процессов регенерации кроветворения введением чужеродной ДНК [6]. В то же время на фоне терапии фрагментированной ДНК животных с РМЖ отмечено возрастание количества спленоцитов, ядросодержащих клеток костного мозга и костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток по сравнению с контрольной группой по РМЖ. Нами не найдено литературных данных, в которых также бы исследовали количественный состав органов гемо- и лимфопоэза на фоне ПХТ и дополнительного введения экзогенной ДНК. Кроме этого, получены новые данные о функциональной активности мононуклеаров лимфы грудного протока, спленоцитов, ядросодержащих клеток костного мозга (пролиферативный потенциал, цитокинпродуцирующая активность), которые также указывают на разнонаправленное влияние фрагментированной ДНК. Так, под влиянием фрагментированной ДНК отмечено снижение пролиферативного потенциала клеток КМ и спленоцитов по сравнению с контрольной группой животных по РМЖ.
Заключение
Следовательно, исходя из изложенного, необходимо учитывать вероятность благоприятного влияния фрагментированной ДНК на пролиферативный потенциал опухолевых клеток и с осторожностью назначать его при онкопатологии.
Выражаем благодарность за техническую и организационную помощь в проведении экспериментов Алямкиной Е.А., Долговой Е.В., Рогачеву В.А. и Богачеву С.С., сотрудникам ИЦИГа.
Рецензенты:
Бгатова Н.П., д.б.н., зав. лабораторией ультраструктурных исследований, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск;
Горчаков В.Н., д.м.н., зав. лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 04.06.2014.