Проблема улучшения регенерации раневых повреждений кожи и мягких тканей различного генеза обусловлена высоким процентом вторичного инфицирования, глубокими метаболическими сдвигами на фоне высокой выраженности воспалительных реакций, активации кислород-независимого фагоцитоза и интенсификации свободно-радикальных реакций [2, 5, 6]. Использование раневых покрытий, выполненных на основе природных биодеградируемых полисахаридных полимеров, в частности хитозана, является перспективным направлением регенеративной медицины [3, 8]. Хитозан в составе различных композиций обладает полифункциональными свойствами, биосовместим, экологически безопасен и находит широкое применение в медицине [1, 4, 7].
Цель работы ‒ выявить особенности регенераторного процесса условно-асептической полнослойной кожной раны у крыс под влиянием различных вариантов раневых покрытий на основе хитозана.
Материалы и методы исследования
В качестве раневых покрытий в работе использовали гидрогель на основе низкомолекулярного хитозана, а также раневое покрытие, выполненное в виде пленки, содержащей ферментный антиоксидант церулоплазмин, L-аспарагиновую кислоту, пластификатор – глицерин (заявка на изобретение № 2013114222, приор. от 28.03.2013, реш. о выдаче патента на изобретение от 12.03.2014). Исследование проводили на 40 беспородных половозрелых белых крысах-самцах, в возрасте 6–7 мес., массой тела 180 ± 30 г. Проведение эксперимента не противоречило Женевской конвенции 1985 г. «Международные биомедицинские исследования с использованием животных» и «Протоколу исследований», утвержденному комитетом по этике ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет Росздрава РФ» (Протокол № 13 от 10.04.2007 г.). Животные содержались в условиях вивария, отвечающих стандартным требованиям, со свободным доступом к пище и воде в индивидуальных послеоперационных клетках.
Формирование полнослойной кожной раны 30 крысам осуществляли путем иссечения полнослойного кожного лоскута в межлопаточной области площадью 400 мм2 в асептических условиях под общей анестезией (внутримышечно комбинация золетила («Virbac Sante Animale», Франция) в дозе
0,1 мл/кг и ксилазина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/к). Всем животным рану тщательно обрабатывали изотоническим раствором хлорида натрия, затем 10 животным первой опытной группы на поврежденную поверхность наносили гидрогель на основе хитозана, 10 крысам второй опытной группы – раневое покрытие в виде пленки. У 10 животных группы сравнения рана заживала самостоятельно. 10 интактных крыс составили группу контроля при проведении биохимического мониторинга.
Скорость заживления ран оценивали каждые сутки (в %) с использованием планиметрических методов. В исследовании использовали планиметрический метод, предложенный Г.М. Ярмольчук (1980), Г.Г. Автандиловым (1990) и основанный на регистрации скорости уменьшения площади раневого дефекта. При контрольных исследованиях визуально оценивали наличие и характер воспалительно-репаративных процессов по состоянию краев и дна раны, срокам появления грануляций и особенностям эпителизации ран.
В динамике производили бактериологические исследования раневой поверхности с использованием стандартных методик. В случае присоединения вторичного инфицирования идентификацию выделенных штаммов проводили с помощью микробиологического анализатора BBL Auto Reader BD (США).
С целью оценки активности процессов липопероксидации определяли уровень малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Коробейникова Э.Н., 1989). Состоятельность системы антиоксидантной защиты оценивали по активности сывороточного ферментного антиоксиданта церулоплазмина (ЦП) в реакции окисления раствора парафенилендиамина с пересчетом результатов в условные единицы (Колб В.Г., Камышников В.С., 1976).
Цитологическое исследование проводили, изучая мазки-отпечатки, полученные на 3, 5, 7, 10 и 14 сутки с поверхности раневого дефекта после отделения струпа и окрашенные цитологическим красителем «Лейкодиф 200». Производили подсчет количества нейтрофильных лейкоцитов и клеток фибробластического ряда в пересчете на 100 клеток. Изменение количества клеточных элементов относительно нормальных величин рассматривали как критерий активности процесса восстановления.
Морфо-гистохимические исследования выполняли после выведения крыс из эксперимента. Фрагменты тканей, полученные из области раневых дефектов, фиксировали в нейтральном забуференном 10 %-ном формалине, в последующем осуществляли проводку в спиртах восходящей плотности и заливку в парафин. Готовили с помощью микротома срезы тканей толщиной 5 мкм, окрашивали их гематоксилин-эозином для дифференцировки структурных элементов. Гликозаминогликаны выявляли при окрашивании тканей альциановым синим при рН = 1,0 (высокосульфатированные гликозаминогликаны) и при рН = 2,5 (суммарные сульфатированные гликозаминогликаны). Коллагеновые волокна визуализировали в реакции Ван-Гизон трихром и Массон трихром с анилиновым синим. Кроме того, проводили идентификацию коллагеновых и эластических волокон по Вейгерт Ван-Гизон и Маллори трихром.
Статистическую обработку полученных численных результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0.
Результаты исследования и их обсуждение
При планиметрическом исследовании выявлено, что применение раневого покрытия оказывало выраженное влияние на регенерацию неинфицированной раны по отношению к группе сравнения и к показателям первой опытной группы во все сроки проведения контрольных измерений. К 10-м суткам наблюдения у всех животных второй опытной группы и 70 % первой опытной группы наблюдали полное заживление раневой поверхности. На 14-е сутки наблюдения у всех крыс первой опытной группы отмечалась эпителизация раневого дефекта. Несколько иные сроки заживления характеризовали группу сравнения. Так, у 8 крыс этой группы заживление ран происходило только к 21-м суткам опыта, при этом у 2 животных сохранялся незначительный раневой дефект, вызванный его вторичным инфицированием (таблица).
Бактериологические исследования поверхности ран животных обеих опытных групп подтвердили асептическое их состояние. У двух животных группы сравнения на 5 сутки после операции из раны была высеяна E. coli (3,8 ± 1,3 КОЕ), что свидетельствовало о присоединении вторичной инфекции, которая сохранялась до завершения исследования, то есть до 21 суток наблюдения, и сопровождалась явлениями отечности и выраженной гиперемии краев раны, гнойным отделяемым, скоплениями некротических масс на дне раны и увеличением сроков ее регенерации.
Цитологически у животных всех групп в 1-е сутки наблюдения доминировали гранулоциты, встречались лишь единичные фибробласты, лимфоциты и макрофаги. Третьи сутки с момента формирования раны, когда формируется картина воспаления, принимают за исходные. В это время у крыс обеих опытных групп в периферических участках повреждения отмечали очаги полиморфно-нуклеарной инфильтрации и единичные скопления гистиоцитов. Дно раны было покрыто значительным количеством миофибробластов, гистиоцитов. Визуально подлежащие ткани характеризовались наличием участков грануляционной ткани, отчетливых признаков краевой эпителизации, выраженного полнокровия кровеносных сосудов. На 5-е сутки произошло снижение (p < 0,01) числа доминирующих нейтрофилов по сравнению с исходными показателями (соответственно 93,25 ± 0,63 и 98,34 ± 1,17 – 1-я опытная группа и 97,44 ± 1,45 и 84,13 ± 0,22 – 2-я опытная группа), а также появились клетки фибробластического ряда. На 5-е сутки полнокровие сосудов уменьшалось у крыс обеих опытных групп. У животных группы сравнения на 5-е сутки в цитограмме преобладали нейтрофильные лейкоциты, отмечалось некоторое их снижение (в 0,89 раза) по сравнению с исходными показателями за исключением особей с вторичным инфицированием ран. К 7 суткам наблюдения происходило дальнейшее снижение содержания нейтрофилов у крыс 1-й опытной группы (до 35,18 ± 1,3) с одновременным повышением содержания фибробластов в 67,4 раза по сравнению с исходными показателями. На 14-е сутки эксперимента наблюдалось снижение числа нейтрофильных лейкоцитов в 2,6 раза (до 25,70 ± 0,67) и увеличение количества фибробластов до 60,3 ± 1,8.
Изменение площади экспериментальных ран (мм2) у животных группы сравнения и
опытных групп (М ± m)
|
Сроки наблюдения, сутки |
Группа сравнения |
Первая опытная группа (n = 10) |
Вторая опытная группа (n = 10) |
|
1-е |
390,05 ± 3,25 |
392,00 ± 0,89 |
389,16 ± 2,11 |
|
3-и |
334,00 ± 7,10 |
231,45 ± 4,29 р1 < 0,001 |
117,41 ± 1,88 р2 < 0,001 р3 < 0,001 |
|
5-е |
221,37 ± 9,79 |
109,08 ± 2,22 р1 < 0,001 |
56,11 ± 1,26 р2 < 0,001 р3 < 0,001 |
|
7-е |
153,40 ± 7,46 |
34,60 ± 3,81 р1 < 0,001 |
11,40 ± 0,73 р2 < 0,001 р3 < 0,001 |
|
10-е |
87,41 ± 2,80 |
22,31 ± 1,16 р1 < 0,001 |
0,00 |
|
14-е |
19,28 ± 3,44 |
0,00 |
|
|
21-е |
2,90 ± 0,21 |
Примечания: р1 – разница показателей между 1-й опытной группой и группой сравнения; р2 – разница показателей между 2-й опытной группой и группой сравнения;
р3 – разница показателей между 1-й и 2-й опытными группами.
Биохимический мониторинг показателей перекисно-антиоксидантного баланса в сыворотке крови показал, что уровень МДА у животных первой опытной группы (2,83 ± 0,11 мкмоль/л) уже на 4-е сутки наблюдения был существенно ниже (p < 0,05), чем у крыс группы сравнения (3,21 ± 0,12 мкмоль/л) и приближался к нормальным значениям (2,74 ± 0,13 мкмоль/л) уже к 8-м суткам. В группе сравнения данный показатель оставался повышенным на протяжении всего периода наблюдений, особенно у животных с явлениями вторичного инфицирования. На 7-е сутки у крыс первой и второй опытных групп повышается (p < 0,001) активность церулоплазмина (соответственно 23,46 ± 0,65 у.е. и 31,82 ± 0,67 у.е.) в отличие от показателей животных группы сравнения (18,36 ± 0,43 у.е.). Следует отметить, что активность церулоплазмина была существенно выше у крыс второй опытной группы (p < 0,001) по сравнению с таковыми второй.
Гистологически на 3-и сутки в регенерирующей ткани определяли фибробласты, гранулоциты, незначительное количество макрофагов и лимфоцитов. В отличие от группы сравнения в более короткие сроки (в 1,2 раза) происходило уменьшение признаков перифокального отека, освобождение от фибринозно-некротического экссудата.
При выведении животных из эксперимента на 21-е сутки наблюдения у крыс группы сравнения регенерат был представлен плотной рубцовой тканью, химически характеризующейся значительным объемом сульфатированных гликозаминогликанов, отсутствием полноценных структурных компонентов. Коллагеновые волокна дезориентированы, расположены беспорядочно. У крыс обеих опытных групп на 21-е сутки образовывался полноценный соединительнотканный матрикс с горизонтально ориентированным зрелым коллагеном. Отмечено формирование полноценных кожных структур со сформированными сальными железами. У крыс групп сравнения в те же сроки отмечено наличие участков метахромазии, коллагеновые волокна расположены хаотично, реже – вертикально по ходу сосудов.
Заключение
Использование в отношении условно асептических ран препаратов на основе природного биополимера хитозана сокращает сроки экссудативной фазы воспалительной реакции, оказывает стимулирующее влияние на пролиферативную фазу, способствует синтезу зрелого коллагена и фиброзной трансформации. Кроме того, препараты на основе хитозана оказывают антиоксидантное, антибактериальное и регенерирующее действие, более выраженное у формы, содержащей дополнительные активные компоненты (церулоплазмин, L-аспарагиновую кислоту).
Рецензенты:
Волков А.А., д.в.н., профессор, заведующий кафедрой терапии, акушерства и фармакологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.И. Вавилова», г. Саратов;
Гладилин Г.П., д.м.н., профессор, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России, г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 07.05.2014.