Активация протеолиза является причиной развития многих патологических процессов [2]. При очевидной важности данной проблемы выбор лекарственных средств, способных оказывать воздействие на систему протеолиза, в настоящее время весьма ограничен. Этилметилгидроксипиридина сукцинат и морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат широко используются при различных патологических процессах, в том числе и при интоксикации алкоголем. В настоящее время доказана антиоксидантная активность данных лекарственных средств [3, 4, 7], но их действие на протеолиз не изучено.
Цель работы – исследовать влияние этилметилгидроксипиридина сукцината и морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетата на протеолиз при хронической алкогольной интоксикации.
Материалы и методы исследования
Для проведения экспериментов использовали половозрелых самцов крыс линии Wistar средней массой 360 г. Животные содержались в стандартных условиях специализированного вивария НИЛ УО «Витебский государственный медицинский университет». Для эксперимента отбирали животных, предрасположенных к добровольному потреблению алкоголя. Разделение животных по степени мотивации потребления алкоголя осуществляли с помощью теста «этанолового наркоза» путем однократного внутрибрюшинного введения 25 % раствора этанола [1]. Модель хронической алкогольной интоксикации воспроизводилась путем предоставления животным 15 % раствора этанола ad libitum в качестве единственного источника питья [1]. Животным контрольных групп в качестве источника питья предоставляли водопроводную воду. Длительность потребления животными раствора этанола составляла 29 недель. Введение лекарственных средств опытным группам крыс осуществлялось в хвостовую вену в следующих дозах: этилметилгидроксипиридина сукцинат – 10 мг/кг массы тела животного, морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат – 50 мг/кг массы тела животного. Контрольным группам животных внутривенно вводили эквиобъемное количество физиологического раствора. Интенсивность протеолиза в сыворотке крови экспериментальных животных изучали через 1, 3 и 7 суток после отмены этанола.
Исследование интенсивности протеолиза в сыворотке крови крыс осуществляли с использованием высокостабильного в растворе, низкомолекулярного хромогенного субстрата N-α-бензоил-D,L-аргинин-пара-нитроанилида (БАПНА). Для определения общей протеолитической активности сыворотки крови применяли метод, описанный Erlanger B. и др. [9]. При изучении активности α1-протеиназного ингибитора и α2-макроглобулина сыворотки крови использовали методики, предложенные Хватовым Т.А. и соавт. и Карягиной И.Ю. и соавт. [5, 6]. При исследовании активности эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в сыворотке крови применяли метод Lenney J.F. [10].
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью непараметрических методов (тесты Манна – Уитни и Краскела – Уоллиса, применялась поправка Бонферрони).
Результаты исследования и их обсуждение
При хронической алкогольной интоксикации установлено снижение активности α1-протеиназного ингибитора в течение 7 суток после отмены этанола (на 11,44 %, р = 0,0027 и 9,49 %, р = 0,0027 через 3 и 7 суток соответственно) (таблица). Аналогичные изменения были отмечены и для α2-макроглобулина во все периоды наблюдений: снижение его активности на 1 сутки составило 52,63 % (р = 0,0044), 3 сутки – на 42,98 % (р = 0,0027), 7 сутки – 48,24 % (р = 0,0027). В то время как общая протеолитическая активность сыворотки крови и активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ не подвергались изменениям. Снижение активности α1-протеиназного ингибитора и α2-макроглобулина может быть обусловлено повышенной потребностью ингибиторов вследствие активации протеолиза. Таким образом, с учетом того, что при хронической алкогольной интоксикации имеет место нарушение протеиназо-ингибиторного баланса, данное состояние может служить моделью для того, чтобы оценить способность этилметилгидроксипиридина сукцината и морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетата оказывать влияние на систему протеолиза.
Активность протеолитических ферментов и их ингибиторов в сыворотке крови
|
Показатель |
Контрольная группа (n = 7) |
1 сутки после отмены этанола (n = 6) |
1 сутки после отмены этанола + этилметил-гидроксипиридина сукцинат (n = 6) |
1 сутки после отмены этанола + морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат (n = 6) |
3 суток после отмены этанола (n = 6) |
3 суток после отмены этанола + этилметил-гидроксипиридина сукцинат (n = 6) |
3 суток после отмены этанола + морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат (n = 6) |
7 суток после отмены этанола (n = 6) |
7 суток после отмены этанола + этилметил-гидроксипиридина сукцинат (n = 6) |
7 суток после отмены этанола + морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат (n = 6) |
|
Общая протеолитическая активность сыворотки крови, нмоль/с·л. |
23,37 |
37,39 |
34,80 |
50,125 |
23,63 |
21,56 |
26,750 |
20,78 |
31,17 |
34,023 |
|
(19,93–33,65) |
(30,63–45,41) |
(15,72-60,46) |
(23,484–71,745) |
(14,25 – 41,50) |
(14,85-37,78) |
(18,345–33,770) |
(11,83–40,28) |
(18,08-45,98) |
(16,431–52,999) |
|
|
Активность α1-протеиназного ингибитора сыворотки крови, мкмоль/с·л. |
5,72 |
5,43 |
5,35 |
5,241 |
5,07* |
5,21* |
5,110* |
5,18* |
5,33 |
5,016* |
|
(5,47–5,80) |
(5,31–5,57) |
(5,26-5,57) |
(4,908–5,536) |
(4,97–5,20) |
(4,93-5,39) |
(4,982–5,400) |
(4,79–5,31) |
(4,89-5,59) |
(4,723–5,329) |
|
|
Активность α2-макроглобулина, мкмоль/с·л. |
0,23 |
0,11* |
0,12* |
0,093* |
0,13* |
0,11* |
0,151 |
0,12* |
0,21 |
0,176 |
|
(0,18–0,27) |
(0,09–0,12) |
(0,09-0,17) |
(0,056–0,175) |
(0,10–0,15) |
(0,08-0,16) |
(0,106–0,181) |
(0,09–0,14) |
(0,11-0,26) |
(0,109–0,226) |
|
|
Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ, отн. ед. |
4030,73 |
4089,83 |
3894,79 |
3701,298 |
4036,64 |
3770,69 |
3889,610 |
4143,03 |
3766,23 |
4162,337 |
|
(3791,39–168,76) |
(3884,31–4423,02) |
(3642,99-4122,97) |
(3236,857–4200,370) |
(3843,40–4206,24) |
(3512,04-4163,29) |
(3720,967–4092,884) |
(3576,209–4477,39) |
(3672,88-3850,93) |
(3759,055–4409,775) |
Примечания:
1. Данные представлены в виде медианы (–95...+95 %) – доверительный интервал.
2. * – статистически значимые различия показателей по отношению к контролю.
Этилметилгидроксипиридина сукцинат нормализовал активность α1-протеиназного ингибитора и α2-макроглобулина до уровня контроля к 7 суткам после отмены этанола (р = 0,0222, р = 0,5203).
При использовании морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетата активность α1-протеиназного ингибитора оставалась сниженной (к 3 суткам на 10,67 %, р = 0,0082 и к 7 суткам на 12,32 %, р = 0,0027). Активность α2-макроглобулина на фоне введения морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетата нормализовалась до контрольных значений на 3 и 7 сутки (р = 0,0124 и р = 0,1160 соответственно).
Ни этилметилгидроксипиридина сукцинат, ни морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат не оказали влияния на общую протеолитическую активность сыворотки крови и активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ.
В сыворотке крови крыс контрольной группы этилметилгидроксипиридина сукцинат и морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат не вызывали изменений в системе протеолиза. При моделировании процесса in vitro нами установлено, что внесение в инкубационную смесь этилметилгидроксипиридина сукцината и морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетата не оказало влияния на активность протеиназ и их эндогенных ингибиторов в сыворотке крови [8]. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что этилметилгидроксипиридина сукцинат и морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат не обладают прямым эффектом на изучаемые показатели in vitro, что не исключает возможности регуляции активности протеолитических ферментов и их эндогенных ингибиторов in vivo опосредованным путем.
Возможный механизм влияния этилметилгидроксипиридина сукцината на протеолиз может быть связан с тем, что данное лекарственное средство ингибирует процессы перекисного окисления липидов, уменьшает уровень оксида азота в тканях, а также увеличивает активность антиоксидантных ферментов (в том числе супероксиддисмутазы), что способствует нормализации процессов свободно-радикального окисления и восстановлению функционирования липидного слоя биологических мембран, ионных каналов, рецепторов, мембранно-связанных ферментов, что оказывает модулирующее влияние на активность ферментов и может способствовать восстановлению протеиназо-ингибиторного баланса в тканях.
Морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат снижает гиперпродукцию лактата и уменьшает явления некомпенсированного ацидоза, увеличивает активность антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, каталаза), что также способствует сохранению структурно-функциональной целостности биологических мембран и угнетению процессов окислительной модификации белковых структур рецепторов, ионных каналов и ферментов. С другой стороны, морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат предупреждает обратимую и необратимую модификацию метиониновых и цистеиновых фрагментов белков, снижает интенсивность процесса накопления свободных аминокислот, увеличивает уровень содержания РНК и стимулирует адаптивный синтез белков, что также может способствовать восстановлению нормального физиологического баланса активности протеиназ и их эндогенных ингибиторов.
Таким образом, этилметилгидроксипиридина сукцинат и морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат однонаправлено изменяют активность α1-протеиназного ингибитора и α2-макроглобулина и способствуют нормализации протеиназо-ингибиторного баланса в сыворотке крови крыс в модели хронической алкогольной интоксикации. Несмотря на то, что при введении морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолин-5-тиоацетата через 7 суток после отмены этанола не отмечено достижения уровня контроля, при этом степень выраженности изменений не отличалась при применении этилметилгидроксипиридина сукцината и морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетата.
Выводы
1. Этанол при длительном употреблении приводит к нарушению протеиназо-ингибиторного баланса в сыворотке крови.
2. Этилметилгидроксипиридина сукцинат и морфолиний 3-метил-1,2,4,-триазолил-5-тиоацетат способствуют нормализации протеиназо-ингибиторного баланса сыворотки крови экспериментальных животных.
Рецензенты:
Питкевич Э.С., д.м.н., профессор, зав. кафедрой лечебной физкультуры и спортивной медицины УО «Витебский государственный университет имени П.М. Машерова», г. Витебск;
Осочук С.С., д.м.н., зав. НИЛ УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», г. Витебск.
Работа поступила в редакцию 01.04.2014.