Известно, что у патогенных бактерий биологические свойства проявляются как факторы патогенности. Наибольшее значение имеют бактериальные ферменты, обладающие токсическим действием. Вырабатываемые бактериями, они могут влиять на течение, исход болезни и на иммунитет макроорганизма. Многие энзимы патогенных и условно-патогенных микробов, катализирующие чуждые животному организму реакции, могут являться типичными токсинами, обладающими антигенными свойствами. Ферменты паразитирующих в организме микробов способны образовывать ядовитые продукты, как за счет распада своих составных частей, так и за счет разложения веществ животного организма [6].
Изучение влияния тяжелых металлов на ферментативную активность патогенных микробов является важным, так как многие наступающие при этом изменения в свойствах бактерий могут влиять на их вирулентность, а, следовательно, на скорость и качество течения инфекционного процесса.
Цель работы – изучить влияние ионов тяжелых металлов на ферментативную активность и вирулентные свойства патогенных бактерий – возбудителей сапрозоонозов.
Материал и методы исследования
В качестве объектов исследований были использованы следующие микроорганизмы: Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis; Yersinia pseudotuberculosis: штамм Н-2781, 282. Эксперименты проводили в условиях острого опыта.
Уровень индивидуальной устойчивости бактериальных штаммов к ионам тяжелых металлов: Ni2+, Zn2+, Co2+, Pb2+, Cu2+, Cd2+ оценивали на основе определения максимальной концентрации соли каждого металла, при которой не был отмечен эффект подавления роста культуры [1]. Посев производили в трех повторностях методом отпечатков чистых культур на среду МПА (для Yersinia и Salmonella) с добавками солей металлов в возрастающих концентрациях. Подобраны максимальные концентрации тяжелых металлов, к которым были устойчивы выбранные патогенные бактерии.
Для оценки адгезивной активности в качестве клеточного объекта нами были использованы эритроциты, а показателем адгезии служил СПА – средний показатель адгезии, то есть среднее количество адгезированных клеток штамма на одном эритроците. Адгезивность считали нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой при СПА от 1,01 до 2,0; средней при СПА от 2,01 до 4,0; высокой при СПА больше 4 [2].
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ определения максимальных концентраций солей тяжелых металлов, к которым были резистентны исследуемые тест-микроорганизмы показали, что все взятые в эксперимент штаммы обладали наибольшей устойчивостью к свинцу и никелю, а бактерии рода Salmonella – еще и к меди. При сравнении максимальных концентраций солей тяжелых металлов, к которым устойчивы исследуемые бактерии, были выявлены существенные отличия (табл. 1). Так, штаммы Y. pseudotuberculosis были наименее устойчивы ко всем тяжелым металлам, по сравнению со штаммами бактерий рода Salmonella. По степени уменьшения резистентности штаммов Y. pseudotuberculosis к тяжелым металлам их можно расположить в следующей последовательности: Pb > Ni > Zn > Сu > Со > Cd. Для сальмонелл выявлена другая последовательность: Pb > Ni = Сu > Zn = Со > Cd.
Таблица 1
Максимальные концентрации солей тяжелых металлов (мг/л в пересчете на безводную соль), к которым устойчивы исследуемые штаммы бактерий
|
Штамм |
Pb(NO3)2 |
NiCl2 |
CdCl2 |
ZnCl2 |
CoC12 .6H2O |
CuCl2 .2H2O |
|
Y.pseudotuberculosis штамм Н- 2 781 |
800 |
300 |
20 |
200 |
100 |
200 |
|
Y.pseudotuberculosis штамм 282 |
800 |
300 |
20 |
200 |
100 |
200 |
|
S.typhimurium |
1000 |
400 |
60 |
200 |
200 |
400 |
|
S. enteritidis |
1000 |
400 |
60 |
200 |
200 |
400 |
На втором этапе исследований адаптировали экспериментальные штаммы к максимальным концентрациям поллютантов путем шестикратных ежедневных пассажей (пересевов) на среды, содержащие соли тяжелых металлов. В качестве контроля были взяты эти же штаммы, но не пассированные на средах с тяжелыми металлами. Характер роста культур исследуемых бактерий на среде с металлами не отличался от контроля. Следует отметить наличие коричневого пигмента у исследуемых штаммов бактерий, выросших на среде со свинцом в отличие от контроля.
При изучении влияния ионов тяжелых металлов (Ni +, Zn +, Со2+, Pb2+, Cu2+, Cd2+) на биологические свойства исследуемых патогенных бактерий, было установлено, что последние подвергались изменениям.
Нами была исследована активность следующих ферментов, являющихся факторами патогенности для бактерий: гиалуронидазы, плазмокоагулазы, липазы, фосфатазы, лецитиназы, нитратредуктазы, оксидазы, каталазы, а также было изучено влияние ионов тяжелых металлов на гемолиз и адгезивные свойства исследуемых штаммов (табл. 2).
Таблица 2
Влияние солей тяжелых металлов на средний показатель адгезии у исследуемых бактерий
|
Штамм |
Контроль |
Pb |
Ni |
Cd |
Zn |
Co |
Cu |
|
Y.pseudotuberculosis штамм Н- 2781 |
2,6 ± 0,3 |
16,9 ± 1,7 |
13,1 ± 2,1 |
11,4 ± 1,5 |
12,4 ± 1,8 |
12,2 ± 1,7 |
10,4 ± 1,0 |
|
Y.pseudotuberculosis штамм282 |
10,6 ± 0,7 |
16,1 ± 1,4 |
16,3 ± 1,5 |
15,6 ± 1,8 |
12,2 ± 1,2 |
13,8 ± 2,1 |
13,4 ± 1,8 |
|
S. typhimurium |
10,7 ± l,l |
14,l ± 0,7 |
13,5 ± 1,9 |
5,5 ± 0,7 |
8,2 ± 1,2 |
6,7 ± 0,8 |
6,3 ± 0,6 |
|
S. enteritidis |
10,2 ± 1,3 |
16,4 ± 1,9 |
13,2 ± 1,5 |
10,1 ± 1,4 |
10,3 ± l,3 |
10,9 ± l,4 |
10,5 ± l,6 |
Адгезивная активность микроорганизмов является одним из персистирующих признаков, предназначенная для выполнения их селективной адсорбционно-инвазионной функции по отношению к определенной ткани [5].
Было установлено, что под воздействием ионов тяжелых металлов показатели адгезии для Y. pseudotuberculosis штамм Н-2781 возросли в среднем в 4 и более раз по сравнению с контролем (табл. 2). Наибольшим СПА обладал штамм, подвергавшийся действию ионов свинца. Его СПА соответствовал высокой адгезивности, тогда как контроль обладал средней адгезивностью.
Для сальмонелл, в общем, характерно было угнетающее воздействие металлов на адгезивные свойства, по сравнению с контролем. У обоих штаммов стимулировали адгезию только Pb и Ni. Максимальные значения СПА проявились под воздействием ионов свинца.
Под влиянием тяжелых металлов изменялась гиалуронидазная активность у исследуемых микроорганизмов (табл. 3). Из литературных источников известно, что особенности биологического действия гиалуронидазы обусловлены специфической каталитической активностью этого фермента. Расщепление гиалуроновой кислоты – основного строительного элемента соединительнотканных структур, является той функцией, которая обеспечивает микробу продвижение в тканях [7].
Таблица 3
Влияние солей тяжелых металлов на проявление гиалуронидазной активности у исследуемых бактерий*
|
Штамм |
Контроль |
Pb |
Ni |
Cd |
Zn |
Co |
Cu |
|
Y.pseudotuberculosis штамм Н- 2 781 |
– |
+ + |
– |
– |
+ + |
– |
+ + |
|
Y.pseudotuberculosis штамм 282 |
+ |
+ |
– |
+ + |
– |
– |
– |
|
S.typhimurium |
– |
+ + |
+ + |
+ + |
– |
– |
– |
|
S. enteritidis |
– |
+ + + |
+ |
+ |
– |
– |
– |
Примечание. * результаты оценивали по 3-крестной системе ( + слабая реакция; + + средняя реакция; + + + активная реакция).
Cравнительный анализ результатов показал, что ионы тяжелых металлов могут, как стимулировать, так и угнетать активность гиалуронидазы исследуемых бактерий. При этом не было выявлено закономерности в проявлении активности фермента в зависимости от вида микроорганизма и тяжелого металла.
Было показано, что для Y. pseudotuberculosis только Pb, Zn и Cu стимулировали активность гиалуронидазы у штамма Н-2781 по сравнению с контролем. У штамма 282 Ni, Zn, Co, Сu подавляли активность этого фермента. Повышение активности гиалуронидазы наблюдали у сальмонелл под влиянием Pb, Ni и Cd.
Известно, что липаза расщепляет жирные кислоты, способствуя тем самым разрушению липидных компонентов клеточной стенки [5]. В результате исследований липазной активности было отмечено, что тяжелые металлы не вызывали стимуляцию активности этого фермента у иерсиний и сальмонелл по сравнению с контролем.
Следует отметить, что у всех исследуемых патогенных бактерий ионы тяжелых металлов не оказывали никакого воздействия на такие ферменты как фосфатаза, лецитиназа, каталаза, оксидаза, а также не стимулировали усиление гемолитической активности штаммов.
В результате изучения нитратредуктазной активности было обнаружено, что тяжелые металлы влияли на активность энзима бактерий. Нитратредуктаза синтезирует аммиак, служащий исходным материалом для синтеза аминокислот, амидов и белков [4]. Так появление нитратредуктазной активности наблюдали только у иерсиний, которую стимулировали медь, кадмий и свинец у шт. Н-2781 и шт. 282. У остальных тест-микроорганизмов активность фермента не усиливалась в присутствии тяжелых металлов.
Штаммы, которые обладали наиболее выраженными ферментативными свойствами в присутствии тяжелых металлов, были исследованы в отношении изменения вирулентных свойств по сравнению с контролем.
Для постановки опыта были отобраны следующие штаммы бактерий: Cu-устойчивый и Pb-устойчивый штаммы Yersinia pseudotuberculosis H-2781; Cd- и Ni-резистентные штаммы Yersinia pseudotuberculosis 282; Ni-устойчивый штамм Salmonella typhimurium, Pb-устойчивый штамм Salmonella enteritidis. Контроль – штамм, культивируемый на среде, не содержащей металл (табл. 4).
Интересные результаты были получены в опыте с Рb-устойчивым штаммом Y. pseudotuberculosis H-2781. Так, через сутки после заражения пали мыши, зараженные псевдотуберкулезным микробом, выращенным на свинце. В контроле мыши пали на девятые сутки. На более поздних сроках наблюдали гибель животных от штамма, отягощенного металлом. Большинство мышей пало от малой дозы Рb-устойчивого штамма. Гибель животных в контроле после девятых суток зарегистрирована не была.
Таким образом, мыши, зараженные Pb-устойчивым штаммом Y. pseudotuberculosis Н-2781 погибали быстрее, чем в контроле. При этом максимальное количество животных пало от малой дозы металл-резистентного штамма. Это свидетельствует о том, что свинец усиливал вирулентность псевдотуберкулезного штамма Н-2781, по сравнению с контролем.
Таблица 4
Влияние тяжелых металлов на вирулентные свойства исследуемых бактерий
|
Штамм |
LD50 |
Сроки гибели 50 % мышей (дни) |
|
|
Y.pseudotuberculosis Н-2781 |
контроль |
104–106 |
30 |
|
Си-устойчивый |
104–10б |
30 |
|
|
Pb-устойчивый |
102–104 |
17 |
|
|
Y.pseudotuberculosis 282 |
контроль |
юМо4 |
29 |
|
Ni- устойчивый |
юМо4 |
15 |
|
|
Cd- устойчивый |
102–104 |
19 |
|
|
Salmonella typhimurium |
контроль |
104–106 |
28 |
|
Ni- устойчивый |
104–106 |
20 |
|
|
Salmonella enteritidis |
контроль |
104–106 |
20 |
|
Pb-устойчивым |
102–104 |
6 |
|
В эксперименте с Cd- и Ni-устойчивыми штаммами Y. pseudotuberculosis 282, Ni-резистентным штаммом Salmonella typhimurium было установлено, что они не изменили своих вирулентных свойств по сравнению с контролем (штамм без металла), но уменьшили сроки гибели 50 % животных.
В результате эксперимента со Pb-устойчивым штаммом Salmonella enteritidis было установлено, что свинец ускорял гибель опытных животных. Так, через шесть суток после заражения пали мыши, зараженные максимальной дозой штамма, отягощенного металлом. При этом в контроле мыши гибли на десятые и двадцать четвертые сутки. На более поздних сроках наблюдали гибель животных от более слабых доз Pb-устойчивой культуры. Контрольные мыши не погибали.
Заключение
У иерсиний и сальмонелл адгезия на эритроцитах обеспечивается пилями, расположенными на поверхности клеток [3, 5]. Адгезируясь, на эпителии ЖКТ, они проникают внутрь клетки посредством действия фермента гиалуронидазы, где, размножаясь и разрушая клетку, попадают в кровоток, реализуя там основные факторы патогенности -энтеротоксины и экзотоксины. Таким образом, тяжелые металлы, вызывая усиление адгезивных и инвазивных свойств иерсиний и сальмонелл, увеличивают количество микроорганизмов, проникающих в клетки эпителия, способствуя этим ускорению развития иерсиниозной и сальмонеллезной инфекции. Следовательно, взаимодействие тяжелых металлов с возбудителями сапрозоонозов, при их обитании в объектах окружающей среды, способствует появлению эпидемически опасных штаммов, представляющих угрозу для здоровья человека.
Рецензенты:
Мартынова А.В., д.м.н., профессор кафедры эпидемиологии и военной эпидемиологии, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» министерство здравоохранения России, г. Владивосток;
Кузнецова Т.А., д.б.н., зав. лабораторией иммунологии, ФГБУ НИИЭМ им. Г.П. Сомова СО РАМН, г. Владивосток.
Работа поступила в редакцию 05.12.2013.