Нарушения в системе гемостаза являются одним из распространенных осложнений заболеваний почек, их частота и тяжесть коррелируют со степенью утраты функции почек в ходе прогрессирования заболевания. При хронической почечной недостаточности (ХПН) описаны как геморрагические, так и тромбоэмболические осложнения [6, 15]. У больных ХПН возникают нарушения реологии крови, системы свертывания и противосвертывания, сосудистой стенки, которые приводят к целому ряду клинических проявлений. Основной причиной этих нарушений является уремическая интоксикация, и соответственно их тяжесть уменьшается после начала адекватной заместительной терапии. В то же время гемодиализ как основной метод эфферентной терапии у больных ХПН может усугублять развитие тромбогеморрагических нарушений. Хронический гемодиализ как процедура, связанная с подключением экстракорпорального круга кровообращения, с одной стороны, вносит свой вклад в протромбогенное состояние, вызывая активацию тромбоцитов при контакте с чужеродными поверхностями, снижение уровня кофакторов гепарина и повышая уровень факторов свертывания [18]. С другой стороны, процедура гемодиализа оказывает положительный эффект, снижая уровень уремической интоксикации. Кроме того, больные ХПН, находящиеся на гемодиализе, часто получают как антиагреганты, так и непрямые антикоагулянты с целью предотвращения тромбоза сосудистого доступа, а также в связи с рядом сопутствующих заболеваний. Нами установлено, что ряд эндогенных регуляторов гомеостаза, циркулирующих в крови, таких как эритропоэтин, церулоплазмин, альфа-1-кислый гликопротеин, оказывают положительное влияние на состояние системы гемостаза [1, 2, 5, 9].
Межклеточные взаимодействия в крови оказывают влияние на проявления функциональной активности клеток и имеют значение в осуществлении защитных, восстановительных и патологических реакций [4]. В литературе представлены сведения о роли тромбоцитарно-лейкоцитарных, тромбоцитарно-эритроцитарных и эритроцитарно-лейкоцитарных взаимодействий в патогенезе сепсиса, сердечно-сосудистой, акушерско-гинекологической патологии. Ранее нами были представлены результаты о роли тромбоцитарных рецепторов в реализации тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови [7, 8, 10]. Приводят данные о том, что у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, повышено содержание тромбоцитарно-моноцитарных и тромбоцитарно-нейтрофильных агрегатов с одновременным снижением экспрессии PSGL-1 (гликопротеидный лиганд Р-селектина) на моноцитах [12]. Полагаем, что межклеточные взаимодействия в крови могут вносить вклад в патогенез нарушений гемостаза у больных ХПН, находящихся на заместительной терапии. Цель работы – исследовать роль межклеточных взаимодействий в крови в патогенезе нарушений гемостаза у больных ХПН, находящихся на заместительной терапии.
Материалы и методы исследования
Для реализации поставленной цели использована кровь больных людей с ХПН – пациентов отделения диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Первоначально обследовано 160 больных с терминальной стадией ХПН в возрасте от 22 до 72 лет (средний возраст 45,5 года), получающих гемодиализную терапию на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы «Fresenius» (Германия) 3 раза в неделю в течение 4 часов. После рандомизации в исследование включено 24 больных, из них 12 женщин и 12 мужчин. Группа 1 – контроль (n = 25) представлена клинически здоровыми людьми – добровольцами, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами. Группа 2 – больные ХПН до процедуры гемодиализа (n = 24). Группа 3 – больные ХПН после процедуры гемодиализа (n = 24). Кровь для исследований у больных забиралась из артериального колена артерио-венозной фистулы. Для клинической оценки состояния сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН использовали манжеточную пробу Румпеля–Лееде–Кончаловского и измерение времени кровотечения по Дьюку. Количество тромбоцитов в периферической крови определяли на гематологическом анализаторе фирмы «Orphee» (Япония). Оценка тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий выполнялась методом проточной цитометрии на проточном цитофлюориметре «FACS Canto-II» («Becton Dickinson», США). В качестве реактивов использовали моноклональные антитела: CD61+-FIT («Beckman Coulter», США) – для определения Gp IIb/IIIa; CD41+-FIT («Beckman Coulter», США) – для определения Gp IIb; CD42b+-РЕ («Becton Dickinson Pharmingen», США) – для определения Gp Ib. Субпопуляции лейкоцитов (лимфоциты, моноциты и гранулоциты) выделяли на основании интенсивности экспрессии CD45 и характеристик светорассеяния клеток. Экспрессию на тромбоцитах CD61+; CD41+; CD42b+ оценивали по среднепиковому значению в условных единицах флюоресценции (у.е.ф.). Оценка тромбоцитарно-лейкоцитарных коопераций осуществлялась по относительному количеству лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, взаимодействующих с тромбоцитами. Тромбоцитарно-эритроцитарные взаимодействия исследовали в суспензии эритроцитов и тромбоцитов. Коагрегаты дифференцировали на малые (1–3 эритроцита и 1–3 тромбоцита) и большие (больше 3 эритроцитов и/или тромбоцитов) [4]. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН оценивали по клиническим тестам времени кровотечения и манжеточной пробе Румпеля‒Лееде‒Кончаловского. Эти скрининговые методы позволяют при стандартизированных повреждениях микрососудов кожи (прокол, механическое сдавление извне) провести предварительную оценку сосудисто-тромбоцитарного гемостаза и заподозрить нарушения количественного состава и/или функциональной активности тромбоцитов, а также нарушения гемостатических свойств сосудистой стенки. В авторитетном практическом «Руководстве по диализу» Дж. Даугирдаса и соавт. отмечено, что расстройства гемостаза у больных ХПН, находящихся на диализе, должны оцениваться по времени кожного кровотечения [11]. Особое значение в оценке тромбоцитарно-сосудистых нарушений имеет проба Румпеля‒Лееде‒Кончаловского, позволяющая в клинических условиях оценивать спонтанную и в ответ на механическое воздействие резистентность капилляров и функциональную способность тромбоцитов.
У больных ХПН до процедуры гемодиализа по сравнению с группой здоровых людей время кровотечения удлиняется в среднем на 60 %, количество петехий в манжеточной пробе увеличивается в среднем в 6 раз (табл. 1).
Таблица 1
Клинические тесты оценки гемостаза у больных ХПН (M ± m)
|
Группы Показатели |
Группа 1: здоровые (n = 16) |
Группа 2: ХПН до диализа (n = 24) |
Группа 3: ХПН после диализа (n = 24) |
|
Проба Румпеля-Лееде-Кончаловского, количество петехий |
1,69 ± 0,35 |
10,46 ± 1,54 р1 < 0,001 |
14,50 ± 2,89 р1 < 0,001 р2 < 0,01 |
|
Время кровотечения, с |
85,05 ± 4,11 |
132,60 ± 6,55 р1 < 0,001 |
141,11 ± 7,86 р1 < 0,001 р2 < 0,01 |
Примечание. Здесь и далее р – показатель значимости различий между группами по критериям Краскела‒Уоллиса, Манна‒Уитни, Вальда‒Вольфовитца.
После процедуры гемодиализа время кровотечения удлиняется, а количество петехий на ладонной поверхности предплечья увеличивается в среднем на 6,5 %. Отметим, что ни у одного больного ХПН до процедуры гемодиализа время кровотечения и количество петехий не было меньшим, чем в контрольной группе. После гемодиализа картина становилась более разнородной: из 24 больных время кровотечения у 6 укорачивалось, количество петехий у 4 уменьшалось. Нами не обнаружено статистически значимой связи между клиническими тестами оценки гемостаза и такими показателями, как гемодиализный «стаж» (количество принятых процедур гемодиализа), возраст, пол больных ХПН (табл. 2). Кроме того, не выявлено статистически значимой связи между основными причинами ХПН (хронический гломерулонефрит, хронический пиелонефрит, врожденные пророки развития) и показателями времени кровотечения и количества петехий у больных.
Таблица 2
Корреляционная матрица между показателями клинических тестов оценки гемостаза и некоторыми индивидуальными характеристиками больных ХПН
|
Показатели / психологические тесты |
Количество гемодиализов |
Возраст больного |
Пол больного |
|
Проба Румпеля‒Лееде‒Кончаловского, количество петехий |
R = 0,14 p > 0,05 |
R = 0,03 p > 0,05 |
R = −0,06 p > 0,05 |
|
Время кровотечения, с |
R = 0,08 p > 0,05 |
R = 0 p > 0,05 |
R = 0,14 p > 0,05 |
Примечание. R − коэффициент корреляции Спирмена, р – показатель значимости связи.
Установлено, что у больных ХПН до процедуры гемодиализа адгезия тромбоцитов с нейтрофилами и моноцитами увеличивается, причем в большей степени с моноцитами (прирост 84 %), а не с нейтрофилами (прирост 31 %). В то же время количество тромбоцитарно-лимфоцитарных коагрегатов снижается в среднем на 27 % (табл. 3). После процедуры гемодиализа количество тромбоцитарно-нейтрофильных коагрегатов достигает уровня здоровых людей, а количество тромбоцитарно-моноцитарных и тромбоцитарно-лимфоцитарных коагрегатов значимо не изменяется.
Показателен сам факт тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий, учитывая известные агрессивные свойства лейкоцитов, в первую очередь, фагоцитов. Оказывается, что структурное взаимодействие тромбоцитов с нейтрофилами и моноцитами приводит к взаимной активации этих клеток по аутокринному и паракринному механизмам [19]. В частности, у нейтрофилов и моноцитов повышается адгезия, хемотаксис, хемокинез и фагоцитарная активность, у тромбоцитов – активируется метаболизм, что отражается увеличением синтеза тромбоксана А2 и других факторов. Тромбоцитарно-моноцитарная коагрегация регулирует участие моноцитов не только в фагоцитарных реакциях, но и в коагуляционном каскаде в связи с экспрессией тканевого фактора, β2-интегринов и секрецией цитокинов [14].
Механизмы, опосредующие тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия, до конца не ясны. Полагают, что взаимодействие тромбоцитов с нейтрофилами определяются Р-селектином на тромбоцитах и L-селектином на лейкоцитах, более прочные связи образуются между ICAM-2 и Gp IIb-IIIa на тромбоцитах и β2-интегрином на нейтрофилах [16].
Таблица 3
Тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия у больных ХПН (M ± m)
|
Группы Показатели |
Группа 1: здоровые (n = 25) |
Группа 2: ХПН до диализа (n = 24) |
Группа 3: ХПН после диализа (n = 24) |
|
Тромбоцитарно-нейтрофильные агрегаты, % клеток |
24,58 ± 0,93 |
32,16 ± 4,05 р1 < 0,001 |
26,90 ± 1,58 |
|
Тромбоцитарно-моноцитарные агрегаты, % клеток |
23,12 ± 0,79 |
42,59 ± 5,54 р1 = 0,001 |
32,40 ± 2,57 р1 < 0,001 |
|
Тромбоцитарно-лимфоцитарные агрегаты, % клеток |
20,76 ± 0,63 |
15,17 ± 0,64 р1 < 0,001 |
14,88 ± 0,94 р1 < 0,001 |
Кроме взаимодействия с лейкоцитами, тромбоциты активно вступают в контакт с эритроцитами. В табл. 4 приведены данные о количестве тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов у больных ХПН. Установлено, что до процедуры гемодиализа количество тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов уменьшается за счет малых и больших форм. После процедуры гемодиализа их количество значимо не отличается от значений у здоровых людей. Вероятно, что увеличение тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов у больных ХПН после процедуры гемодиализа обусловлено активацией тромбоцитов при контакте с диализной мембраной [20].
Возможно, что феномен тромбоцитарно-эритроцитарных взаимодействий в крови может отражать трофическую функцию эритроцитов по отношению к кровяным пластинкам, т.к эритроцитарные мембраны могут выступать в качестве доноров фосфолипидов для тромбоцитов. Показано, что в организме происходит прямой и быстрый обмен между плазменными и тромбоцитарными фосфолипидами с последующим их включением в мембранные липиды. Известно, что эритроциты у больных ХПН имеют количественные и качественные изменения фосфолипидного состава мембран: за счет активации процессов свободно-радикального окисления (СРО) снижена подвижность ацильных цепей фосфолипидов и увеличена упорядоченность мембранных липидов и полярность липидного бислоя, повышается содержание фосфатидилсерина на поверхности эритроцита [3]. Важным следствием экстернализации фосфатидилсерина является феномен повышенной адгезивности эритроцитов к сосудистому эндотелию и клеткам крови [13].
Таблица 4
Тромбоцитарно-эритроцитарные взаимодействия у больных ХПН (M ± m)
|
Группы Показатели |
Группа 1: здоровые (n = 25) |
Группа 2: ХПН до диализа (n = 24) |
Группа 3: ХПН после диализа (n = 24) |
|
Малые коагрегаты, ∙109/л |
109,82 ± 8,15 |
76,84 ± 8,08 р1 < 0,01 |
96,68 ± 9,28 |
|
Большие когрегаты, ∙109/л |
10,73 ± 1,87 |
7,48 ± 1,19 р1 = 0,05 |
9,24 ± 1,49 |
|
Всего, ∙109/л |
120,55 ± 9,55 |
84,32 ± 9,12 р1 = 0,01 |
105,92 ± 10,51 |
Кроме этого, нельзя исключить взаимные регуляторные влияния эритроцитов и тромбоцитов. В литературе есть данные о повышении функциональной активности тромбоцитов, контактирующих с эритроцитами, опосредованной увеличением синтеза тромбоксана А2. Механизмы, обеспечивающие тромбоцитарно-эритроцитарные взаимодействия в крови, точно неизвестны. Полагают, что они могут быть связаны с тромбоцитарными рецепторами GрIIIb (CD36) и Gр Ib, но не vWF, тромбоспондином, Р-селектином и СD47 [17]. Экспозиция эритроцитов с тромбоцитами оказывает проагрегантный эффект, приводит к высвобождению тромбоцитарных факторов Р3, Р4, Р10. Механизмом активации тромбоцитов является усиление процессов СРО не только в плазме, самих тромбоцитах, но и в эритроцитах.
Можно предположить, что формирование межклеточных коагрегатов в крови вносит вклад в изменение гемореологии у больных ХПН аналогично тому, как это установлено в патогенезе инсулинзависимого сахарного диабета и некоторой хирургической патологии. Установлено, что выраженность геморрагического синдрома, оцениваемая по времени кровотечения и количеству петехий в пробе Румпеля‒Лееде‒Кончаловского, нарастает по мере увеличения количества тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов, статистически значимых связей с количеством тромбоцитарно-лимфоцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов не обнаружено (табл. 5).
Кроме того, изменение кооперации тромбоцитов и эритроцитов у больных ХПН зависит от выраженности анемии. Нами обнаружено, что общее количество тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов до процедуры гемодиализа уменьшается по мере снижения количества эритроцитов в периферической крови (коэффициент корреляции Спирмена R = 0,65; р < 0,05). Общеизвестно, что эритроцитам принадлежит ключевая роль в формировании гемореологии, особенно на уровне микроциркуляции, что определяется их количеством и поведением в кровотоке.
Таблица 5
Корреляционная матрица между клиническими тестами геморрагического синдрома и гематологическими показателями у больных ХПН
|
Показатели |
Проба Румпеля‒Лееде‒Кончаловского, петехий |
Время кровотечения, мин |
|
Тромбоцитарно-нейтрофильные агрегаты, % клеток |
R = 0,38 р < 0,05 R = 0,41 р < 0,05 |
R = 0,44 р < 0,05 R = 0,56 р > 0,05 |
|
Тромбоцитарно-моноцитарные агрегаты, % клеток |
R = 0,42 р < 0,05 R = 0,43 р < 0,05 |
R = 0,51 р < 0,05 R = 0,46 р > 0,05 |
|
Тромбоцитарно-лимфоцитарные агрегаты, % |
R = −0,17 р > 0,05 R = −0,09 р > 0,05 |
R = −0,14 р > 0,05 R = −0,11 р > 0,05 |
|
Тромбоцитарно-эритроцитарные агрегаты, ∙109/л |
R = 0,08 р > 0,05 R = −0,16 р > 0,05 |
R = 0,04 р > 0,05 R = −0,07 р > 0,05 |
Примечание. В числителе значения R − коэффициента корреляции Спирмена, р – показателя значимости связи до процедуры гемодиализа, в знаменателе – после гемодиализа.
Выводы
1. У больных ХПН, находящихся на гемодиализе, зафиксирован геморрагический синдром по петехиально-пятнистому типу. Выраженность геморрагического синдрома не зависит от нозологического профиля непосредственной причины ХПН, стажа гемодиализа, возраста и пола.
2. Установлено, что у больных ХПН до процедуры гемодиализа количество тромбоцитарно-нейтрофильных, тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов увеличивается, тромбоцитарно-лимфоцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов – снижается; после процедуры гемодиализа количество тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов достигает уровня здоровых людей.
3. Выраженность геморрагического синдрома у больных ХПН нарастает по мере увеличения количества тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов, снижения количества эритроцитов в периферической крови.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 12-04-31726 «Механизм влияния эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов».
Рецензенты:
Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;
Сашенков С.Л., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии человека, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 03.06.2013.