Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

LUMINESCENT DETERMINATION OF CODEINE IN HUMAN ORGANS

Nemikhin V.V. 2, 1 Kachin S.V. 2 Sagalakov S.A. 2 Shakhvorostova T.S. 1
1 Krasnoyarsk Regional Bureau of Forensic Medical Examination
2 Siberian Federal University
Весьма перспективным методом для определения кодеина в биологических объектах является люминесцентная спектроскопия. Данный метод сочетает в себе высокую чувствительность, селективность, экспрессность определения с относительной простотой аппаратурного оформления. Спектр люминесценции кодеина в 0,05 М растворе серной кислоты представляют собой широкую бесструктурную полосу с характерным максимумом (λлюм) при 345 нм. «Щелочные извлечения» из образцов биоматериала, содержащего кодеин, также люминесцируют с λлюм = 345 нм. Это указывает на возможность его определения в присутствии сопутствующих компонентов. Разработана люминесцентная методика определения кодеина (0,01–0,75 мг/г) в некоторых органах человека. Рассчитанный предел обнаружения составляет 3∙10–3 мг/г, относительное стандартное отклонение не превышает 0,06. Методика успешно апробирована на «модельных» и экспертных образцах печени и стенки желудка с применением независимого метода ВЭЖХ. Полученные результаты люминесцентного определения кодеина в органах человека позволяют рекомендовать разработанную методику для ее использования в практике экспертных учреждений.
The luminescent spectroscopy is very promising method for the determination of codeine in biological objects. This method combines high sensitivity, selectivity, rapidity of the determination with the relative simplicity of the equipment design. The luminescence spectrum of codeine in 0,05 M sulfuric acid solution is a broad structureless band with a characteristic maximum (λlum) at 345 nm. «Alkaline extractions» of samples of biological material containing codeine also luminesce with λlum = 345 nm. This indicates the possibility of the determination in the presence of associated components. The luminescence procedure the codeine (0,01–0,75 mg/g) determination in some human organs was developed. The limit of detection of the codeine is 3∙10–3 mg/g, the relative standard deviation is not more than 0,06. The procedure for the «model» and expert samples of liver and stomach’s side with using HPLC as independent method was successfully approbated. According to results of the luminescence determination of the codeine in human organs the developed procedure can be recommended for using in practice of expert institutions.
luminescence
codeine
human organs
1. Veselovskaya N.V., Kovalenko A.E. Narkotiki: svoistva, deistviye, farmakokinetika, metabolism [Drugs: the properties, action, pharmacokinetic, metabolism]. Moscow, Triada-X, 2000. 206 p.
2. Kataev S.S., Zelenina N.B., Shilova E.A. Opredeleniye dezomorfina v moche [Dezomorfine determination in urine]. Problems of expertise in medicine. 2007. no.1. рр. 32–36.
3. Snyder L.R., Kirkland J.J., Dolan J.W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. John Wiley & Sons, 2009. 960 p.
4. Kokorina N.O. Skrining lekarstvennykh preparatov v biologicheskikh zhidkostyiakh metodom vysokojeffektivnoj zhidkostnoj khromatografii [Drags screening in biological fluids by high performance liquid chromatography (HPLC)]. Novosibirsk, 2010. 18 p.
5. Harvey D. Modern Analytical Chemistry. McGraw-Hill, 2000. 798 p.
6. Kramarenko V.F. Toksikologicheskaya khimiya [Toxicological Chemistry]. Kiev, High School, 1989. 447 p.
7. Nemikhin V.V., Kachin S.V., Sagalakov S.A., Kozel N.A. Luminescentnoe opredeleniye kodeina v nekotorykh lekarstvennykh preparatakh [Codeine luminescence determination in some drags]. Proceedings of the IX Scientific Conference «Analytics of Siberia and the Far East». Krasnoyarsk, 2012. рр. 268.
8. Chalmers R.A., Wadds G.A. Spectrofluorimetric analysis of mixtures of the principal opium alkaloids. Analyst. 1970. Vol. 95. рр. 234–241.

В настоящее время в практике судебно-медицинской экспертизы отмечается рост числа определений наркотического анальгетика кодеина в органах человека. Это связано с увеличением доли смертельных случаев, вызванных употреблением относительно нового, легкодоступного наркотика дезоморфина (сленговое название «крокодил») [1]. В кустарных условиях дезоморфин получают взаимодействием кодеина, выделенного из лекарственных препаратов, со смесью кристаллического йода и красного фосфора [2].

Одним из наиболее распространенных методов определения лекарственных и наркотических веществ в различных объектах является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [3]. Вместе с тем определение этим методом отдельных компонентов, в частности, кодеина, в органах человека требует особо тщательной пробоподготовки, а в ряде случаев − применение токсичных растворителей. Кроме того, сложный состав проб предполагает применение особо чистых элюентов и периодическую регенерацию хроматографических колонок, что ведет к увеличению времени и стоимости анализа [4].

Весьма перспективным может быть использование метода люминесцентной спектроскопии (ЛС), который сочетает в себе высокую чувствительность, селективность, экспрессность с относительной простотой аппаратурного оформления [5].

Цель данной работы – изучение возможности люминесцентного определения кодеина в некоторых органах человека.

Материалы и методы исследования

Приборы и оборудование

Спектры и интенсивность люминесценции исследуемых образцов регистрировали на спектрофлуориметре «Флюорат-02 Панорама» (ООО «Люмэкс», Россия). Управление прибором и обработку результатов осуществляли на персональном компьютере с использованием программного обеспечения «Panorama Pro», версия 2.0.0.

Сравнительный анализ образцов проводили методом ВЭЖХ [4] на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова», г. Новосибирск, Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором и металлической колонкой (2×75 мм), заполненной сорбентом Prontosil 120-5 C18. Обработку хроматограмм проводили на персональном компьютере с использованием базы данных «БД-500» и программного обеспечения «МультиХром», версия 1.5x-E .

Пробоотбор и пробоподготовка

В качестве исследуемого биоматериала использовали образцы печени, стенки желудка, отобранные экспертами Отдела судебно-медицинской экспертизы трупов Красноярского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы.

Навески биоматериала по 20 г, измельчали, тщательно перемешивали, а затем извлекали кодеин по методике [6]. Для этого к полученным пробам добавляли по 40 мл 0,01 М раствора HCI и настаивали 2 часа при постоянном перемешивании. Жидкие фазы отделяли центрифугированием (2500 об/мин) в течение 30 мин, а к твердым фазам добавляли по 20 мл 0,01 М HCI и повторяли операции, описанные выше.

Объединенные водные растворы трижды экстрагировали диэтиловым эфиром порциями по 20, 15, 15 мл в течение 15 минут. Эфирные экстракты отбрасывали, а водные растворы последовательно экстрагировали порциями по 15 мл в смеси хлороформ – бутанол (9:1) при рН = 8, хлороформа (рН = 10), диэтилового эфира (рН = 13). Экстракты «щелочных извлечений» кодеина объединяли, фильтровали через бумажный фильтр («красная лента») и упаривали досуха при комнатной температуре в чашках Петри. Полученные сухие остатки растворяли в 5 мл хлороформа. Эффективность извлечения кодеина в данном случае составляет около 85 %.

Для проведения люминесцентного анализа в пенициллиновые флаконы емкостью 15 мл отбирали по 2 мл полученных хлороформных растворов, упаривали досуха в токе воздуха при температуре 40 °С и сухие остатки растворяли в 5 мл 0,05 М H2SO4. Спектры люминесценции снимали в диапазоне длин волн 310–590 нм при длине волны возбуждения 300 нм [7].

Для сравнительного анализа методом ВЭЖХ также отбирали по 2 мл полученных хлороформных растворов, проводили операции, как описано выше, а сухие остатки растворяли в 1 мл метилового спирта. Аликвоты полученных спиртовых растворов по 0,1 мл помещали в специальные пробирки для ВЭЖХ и проводили измерения при следующих условиях: УФ-детектирование в диапазоне длин волн 220–300 нм (базовая длина волны – 210 нм); элюенты: А – [4,0 М LiClO4 в 0,1 M HClO4]:H2O в соотношении 5:95, В – ацетонитрил (в режиме градиентного элюирования); скорость потока элюентов – 200 мкл/мин; температура колонки – 40 °С; объем водимой пробы – 5 мкл.

Результаты исследования и их обсуждение

Спектр люминесценции раствора кодеина в 0,05 М H2SO4. представляют собой широкую бесструктурную полосу с характерным максимумом (λлюм) при 345 нм (рис. 1) [8].

pic_81.tif

Рис. 1. Спектр люминесценции раствора кодеина (1 мг/мл) в 0,05 М H2SO4

Предварительные эксперименты показали, что «щелочные извлечения» из образцов биоматериала, содержащего кодеин, также люминесцируют с λлюм = 345 нм. Это указывает на возможность его определения в присутствии сопутствующих компонентов.

Содержание кодеина в биоматериале можно определять по градуировочным графикам, полученным с использованием стандартных растворов, биоматериала, не содержащего кодеин, или методом добавок.

На рис. 2 в качестве примера приведен градуировочный график для люминесцентного определения кодеина, полученный с использованием стандартных растворов. Предел обнаружения кодеина, рассчитанный по 3S-критерию, составил 3 мкг/мл (n = 3, P = 0,95). Градуировочный график линеен до 1,0 мг кодеина на 1 мл раствора.

pic_82.tif

y = 6,040∙x; R2 = 0,998

Рис. 2. Градуировочный график для люминесцентного определения кодеина (λвозб = 300 нм, λлюм = 345 нм)

Содержание кодеина (Q, мг/г) в биоматериале можно рассчитать по уравнению:

Q = (C∙V1∙V3∙100)/(V2∙mн∙R), (1)

где C – концентрация кодеина, рассчитанная по градуировочному графику; V1 – общий объем раствора «щелочных извлечений» кодеина в хлороформе (5 мл); V2 – аликвотная часть раствора «щелочных извлечений» кодеина в хлороформе для его количественного определения (2 мл); V3 – объем раствора «щелочных извлечений» кодеина в H2SO4 (5 мл); mн – масса навески биоматериала (20 г); R – процент извлечения кодеина (85 %).

В табл. 1 приведены результаты люминесцентного определения кодеина в «модельных образцах» печени.

Таблица 1

Результаты люминесцентного определения кодеина в «модельных образцах» печени (n = 3, P = 0,95)

Содержание кодеина (Q ± δ), мг/г

S

Sr

Введено

Найдено

0,050

0,047 ± 0,007

0,003

0,06

0,100

0,105 ± 0,009

0,004

0,04

0,250

0,245 ± 0,017

0,007

0,03

Как видно из табл. 1, полученные результаты методом «введено – найдено» удовлетворительно совпадают. Относительное стандартное отклонение не превышает 0,06.

Вместе с тем при проведении серийных анализов представляется более оправданным определять содержание кодеина в органах человека по градуировочному графику, полученному с использованием матрицы биоматериала. Для этого в навески биоматериала (20 г), не содержащего кодеин, добавляли стандартные растворы кодеина фосфата в этиловом спирте (1 мг/мл) и проводили пробоподготовку, как описано выше. В этом случае прямолинейная зависимость интенсивности люминесценции от содержания кодеина сохраняется в диапазоне 0,01–0,75 мг/г, а предел обнаружения составляет 3∙10–3 мг/г.

Исследование экспертных образцов. Для апробации разработанной методики люминесцентного определения кодеина в органах человека был взят случай реального отравления кодеинсодержащими препаратами. Исследованию были подвергнуты образцы печени и стенки желудка. В табл. 2 приведены сравнительные результаты определения кодеина методами ЛС и ВЭЖХ.

Таблица 2

Результаты определения кодеина в экспертных образцах методами ЛС и ВЭЖХ (P = 0,95; n = 3)

Экспертный образец

Содержание кодеина (Q ± δ), мг/г

Метод ЛС

Метод ВЭЖХ

Печень

0,040 ± 0,005

0,035 ± 0,005

Стенка желудка

0,133 ± 0,009

0,126 ± 0,012

Как видно из табл. 2, результаты люминесцентного определения кодеина в экспертных образцах удовлетворительно совпадают с данными независимого метода ВЭЖХ.

Полученные результаты люминесцентного определения кодеина в органах человека позволяют рекомендовать разработанную методику для ее использования в практике экспертных учреждений.

Выводы

1. Разработана люминесцентная методика определения кодеина (0,01–0,75 мг/г) в некоторых органах человека.

2. Методика успешно апробирована на «модельных» и экспертных образцах печени и стенки желудка с применением независимого метода ВЭЖХ.

3. Полученные результаты люминесцентного определения кодеина в органах человека позволяют рекомендовать разработанную методику для ее использования в практике экспертных учреждений.

Рецензенты:

Парилов С.Л., д.м.н., доцент кафедры судебной медицины ИПО, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Красноярск;

Бурмакина Г.В., д.х.н., главный научный сотрудник Института химии и химической технологии СО РАН, г. Красноярск.

Работа поступила в редакцию 29.12.2012.