Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

THE INFLUENCE OF KOBALAMINA ON THE HEMOSTASIS AND LIPIDPEROXIDATION BEI HYPERCHOLESTEROLEMIA

Tarasov D.B. 1 Byshevskii A.S. 1 Volosatov A.A. 1 Sulkarnaeva G.A. 1 Shapovalov P.I. 1 Shapovalova E.M. 1 Shumkova M.V. 1
1 GBOU VPO «Tyumen State Medical Academy of the Ministry of Health of Russia»
Дополнительное введение высоких доз холестерола с рационом ускоряет непрерывное внутрисосудистое свертывание крови до уровня начальной стадии ДВС крови. Избыток кобаламина в дозах, адекватных малым лечебным, ограничивает эти сдвиги, а в дозах, адекватных высоким – усиливает их, и ограничивает вызываемое введением холестерола снижение толерантности к тромбину. Сдвигам скорости внутрисосудистого свертывания сопутствует ускорение липидпероксидации, снижение антиоксидантного потенциала тромбоцитов и активация фибринолиза. Всё это обусловливает необходимость изучения эффектов разных доз кобаламина на НВСК и ТкТР в клинике, особенно при состояниях с гипертромбинемией. Состояние гемостаза зависит от обеспеченности организма кобаламином, влияющим на тромбоцитопоэз, активность тромбоцитов и плазминовой системы, особенно на фоне атеросклеротических изменений в сердечно-сосудистой системе.
Additional introduction of high doses of cholesterol in the diet accelerates continuous clotting the blood up to the level of the initial phase of ICE. Excess kobalamina in doses appropriate to the small therapeutic limits these shifts, and at doses of adequate high-makes them and limit caused by the introduction of cholesterol reduced tolerance to trombinu. Change the speed of the intravascular coagulation now lipidperoksidacii acceleration, welcomed the antioxidant potential of tromboci and activation of fibrinolysis. All this makes it necessary to study the effects of different doses of cobalamin on NVSK and TkTR in clinic, especially in States with gipertrombinemiei. State of homeostasis of the organism depends on the availability of cobalamin affecting thrombocytopoiesis, platelet activity and plasmin system, especially given the atherosclerotic changes in the cardiovascular system.
kobalamin
hemostas
lipidperoxidation
hypercholesterolemia
1. Baluda V.P., Barkagan Z.S., Gol’dberg E.D. i dr Laboratornye metody issledovanija sistemy gemostaza. Tomsk. 1980. 310 р.
2. Barkagan Z.S., Rudnickaja T.A., Kolpakov M.A.Narushenie obmena gomocisteina u bol’nyh saharnym diabetom 2 tipa / Tromboz, gemostaz i reologija. 2006. no. 3(27). рр. 20–24.
3. Barkagan Z.S., Momot A.P. Osnovnye metody laboratornoj diagnostiki narushenij sistemy gemostaza. Barnaul. 1998. рр. 83–84
4. Byshevskij A.Sh. Vitaminy i gemokoaguljacija. Sverdlovsk: Sredne-Ural’skoe knizhnoe izdatel’stvo. 1978. 124 p.
5. Byshevskij A.Sh., Mohnatov V. Metod opredelenija antiplazmina v syvorotke krovi / Sistema svertyvanija krovi i fibrinoliza. Kiev: Zdorov’ja. 1969. pp. 220–221.
6.Byshevskij A.Sh. A.S. «Sposob opredelenija soderzhanija produktov degradacii fibrina» № 1659855, registracija 1.03. 1991, publikacija Bjull. no. 24, 30.06. 1991.
7. Byshevskij A.Sh. Sposob opredelenija tolerantnosti zhivotnyh k trombinu / A.Sh.Byshevskij, L.V. Mihajlova, R.G. Alborov i dr. // Patent no. 2219546, prioritet ot 04.05.2000, zaregistrirovan v Gosreestre izobretenij RF 20.12.2003.
8. Glanc S.A. Medikobiologicheskaja statistika // M.: Praktika. 1998. 112 p.
9. Kudrjashov B.A. Biologicheskie problemy reguljacii zhidkogo sostojanija krovi. M.:Medicina. 1975. 488 p.
10. Lavrov B.A., Terent’eva E.L. Soderzhanie limonnoj kisloty v krovi krys pri dlitel’noj dache bol’shih doz vitamina D. Vopr. Pitanija. 1963. no. 3. pp. 68–72.
11. Momot A.P., Elykomov V.A., Barkagan Z.S. Metodika i klinicheskoe znachenie fenantrolinovogo testa / A.P.Momot, Klin. labor. Diagnostika. 1999. no. 4. pp. 17–20
12. Ushkalova V.N., Ushkalova, Ioanidis N.V. Deeva Z.M. i dr. Kompleksnyj analiz lipidov krovi spektrofotometricheskim, fluorometricheskim i kineticheskim metodami / Lab. delo. 1987. no. 6. pp. 446–460.
13. Sharaev P.N. Vitaminy i zdorov’e / P.N. Sharaev // Izhevsk: «Jekspertiza». 2004. 108 p.
14. Shapovalova E.A. Mehanizmy gemostaticheskih sdvigov pri otsutstvii i izbytke vitaminov s antioksidantymi svojstvami v racione pitanija (jeksperimental’noe issledovanie): Avtoref. dis. … dokt. biol. nauk, Cheljabinsk, 2010. 48 p.
15. Cetin O. Bekpinar, Unlucerci Y.e.a. Hyperhomocysteinemia in chronic renal failure patients: relation to tissue factor and platelet aggregation / Clin. Nephrol. 2006. no. 65(2). pp. 97–102.
16. Hawk P.W. Practical Physiological Chemistry / Pract. Physiol. Chem. – Phyladelphia. 1923. pp. 953.
17. Herrmann W., Schorr H., R Obeid e.a. Vitamin B12-status, particularly holotranscobalamin II and methylmalonic acid concentrations, and hyperhomocysteinemia in vegetarians / Am. J. Clin. Nutr. 2003 no. 78(1). pp. 131–136.
18. Morel C.F., Lerner J.P., Rosenblatt D.S. Combined methylmalonic aciduria and homocystinuria (cblC): phenotype-genotype correlations and ethnic-specific observations / Mol. Genet. Metab. 2006. no. 88(4). pp. 315–421.
19. Nadir Y., Hoffman R, Brenner B. Association of HC, vitamin B12, folic acid in patients with a thrombotic event or recurrent fetal loss / Ann. Hematol. 2007. no. 86 (1). pp. 35–40.

Сведения о связи кобаламин-гемостаз ограничены, но позволяют утверждать:

1. Состояние гемостаза зависит от обеспеченности организма кобаламином (КБ), влияющим на тромбоцитопоэз, активность тромбоцитов и плазминовой системы, особенно на фоне атеросклеротических изменений в сердечно-сосудистой системе [2, 5, 17, 18].

2. Известны заболевания, протекающие с нарушениями гемостаза и дефицитом КБ [15, 19].

3. В эксперименте и клинике выявлено влияние КБ на некоторые про- и антикоагулянты, однако неясно, как влияет дефицит или дополнительное введение КБ на гемостаз в целом [13].

4. Данные о влиянии КБ на интегральные показатели гемостаза (непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину) единичны [14].

Следовательно, необходимо далее изучать связи между обеспеченностью организма КБ и гемостазом, обращая внимание на эффекты его дефицита и избытка при состояниях, протекающих с тромбофилией или кровоточивостью [14].

Цель работы - изучить влияние на НВСК, фибринолиз и толерантность к тромбину (ТкТР), на липидпероксидацию (ЛПО) и антиоксидантный потенциал (АОП) тромбоцитов при содержании животных на рационе с разными дозами КБ на фоне алиментарной гиперхолестеролемии разного уровня.

Материалы и методы исследований

Опыты провели на нелинейных белых крысах (самцы, 180 ± 16 г), получавших сбалансированный пищевой рацион [4, 9, 10, 18]. Выбор крыс связан с тем, что большинство исследований по изучению гемостаза выполняли на этих животных [17]. В атерогенный рацион входил холестерол (ХЛ) по 0,2 г на особь в сут, чему предшествовало введение 6-метилтиоурацила (0,3 мг на особь в сут, 30 дней), который нарушает обмен липидов, снижая функциональную активность щитовидной железы, что ускоряет развитие гиперхолестеролемии и атеросклеротических сдвигов у крыс, устойчивых к избыточному поступлению с пищей ХЛ [4]. Контрольные группы получали рацион питания без 6-метилтиоурацила и холестерола.

 Пробы крови брали в шприц с 3,8%-м раствором цитрата натрия (9:1 по объему) из обнаженной яремной вены у наркотизированного диэтиловым эфиром животного, фиксированного на препаровочном станке. Рану закрывали 2-3 швами (кетгут). В плазме крови устанавливали уровень маркеров НВСК: продуктов деградации фибрина (ПДФ) [6], растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ) [11], D-димеров («D-dimer test", Roche), фф. Р3 и Р4 в плазме по описанию [1]. Концентрацию в плазме осаждаемого тромбином фибриногена (ФГ) определяли спектрофотометрически [5], а Хагеман-зависимый фибринолиз по описанию [3]. Толерантность к тромбину (ТкТР) устанавливали согласно патенту [7]. Липидпероксидацию (ЛПО) в тромбоцитах и их антиоксидантный потенциал (АОП) оценивали, определяя уровень диеновых конъюгат (ДК) и продуктов, реагирующих с тиобарбитуратом (ТБК), период индукции (ПИ) и скорость окисления (СО) устанавливали по описанию [12] на флуориметре «Биан 130». Число n составляло 8-9 во всех группах и этапах.

Статистический анализ проводили с помощью медико-биологической программы Biostat 4.03 [8], используя вариационную статистику для малых рядов, вычисляя среднюю арифметическую, среднюю ошибку, среднеквадратическое отклонение, доверительный коэффициент Стъюдента и степень вероятности (р). Различия считали достоверными при значениях степени вероятности < 0,05.

Использованы: тромбин, фибриноген (ФГ) бычьей крови, тромбопластин, каолин и буфер Михаэлиса («Технология-стандарт»), набор «D-dimer test» («Roche»), изопропанол, хлорбензол, бутанол и кальция хлорид х.ч., цианокобаламин (ЗАО «Уфавит»), казеин и крахмал маисовый пищевой, масло подсолнечное рафинированное, смесь Осборна-Менделя (все реагенты х.ч.реагенты), ледяная уксусная кислота, концентрированная серная кислота, уксусный ангидрид, абсолютный этанол. Число n во всех группах крыс равно 8.

Результаты исследований и их обсуждение

Вначале изучили эффекты возрастающих доз ХЛ на НВСК, фибринолиз и ТкТР на фоне рациона с кобаламином в соответствии с суточной потребностью (1 мкг/кг - полноценный рацион). Подопытные группы получали ХЛ по 0,2, 0,4 или 0,8 г/кг в сут, пробы брали в конце 6-й и 8-й недели. Из данных таблицы следует, что введение ХЛ (0,2 г/кг) заметно повышает уровень всех плазменных маркеров НВСК (наименьшая доза, использующаяся при оценке влияния ХЛ на атерогенез) к концу 6-й и особенно 8-й недели. Активность фибринолиза не меняется, а ТкТР падает к концу опыта. Увеличение дозы ХЛ в рационе сопровождается пропорциональным ускорением НВСК (выше доза - выше уровни всех маркеров), снижается уровень ФГ, что указывает на его ускоренное потребление, усиливающееся с дозой ХЛ.

Падает и ТкТР, а фибринолиз меняется мало. Уровень липидпероксидов с увеличением дозы ХЛ и длительности введения также повышается, а АОП, напротив, падает.

Изменения НВСК, фибринолиза, ТкТР, ЛПО и АОП при введении возрастающих доз холестерола (0,2, 0,4 или 0,8 г/кг в течение 6 или 8 недель)

Показатели

Полноценный рацион без ХЛ

Тот же рацион с ХЛ (0,2 г, 0,4 и 0,8 в сут) в строках 1, 3 и 3-й через:

6 недель

8 недель

1

2

3

4

Ф, Р3,%

87,9 ± 1,2

101 ± 1,8*

112 ± 1,9*

122 ± 2,3*

101 ± 1,8*

122 ± 1,8*»

127 ± 1,9*»

134 ± 2,2*»

Ф, Р4, с

3,1 ± 0,02

6,2 ± 0,04*

7,9 ± 0,05*

8,8 ± 0,04*

8,2 ± 0,05*»

8,9 ± 0,03*»

10,2 ± 0,06*»

ФГ, г/л

2,1 ± 0,02

1,7 ± 0,08*

1,6 ± 0,04*

1,4 ± 0,09*

1,5 ± 0,08*»

1,3 ± 0,03*»

1,2 ± 0,02*»

ПДФ, мг%

15,1 ± 0,3

19,7 ± 1,1*

23,7 ± 1,4*

29,7 ± 1,8*

23,7 ± 1,4*»

25,7 ± 1,5*»

29,8 ± 1,7*»

РКМФ, мкг/мл

24,1 ± 1,1

31,1 ± 1,2*

35,2 ± 1,4*

41,0 ± 1,8*

31,1 ± 1,2*

38,8 ± 1,3*

40,9 ± 1,6*

D-Д, мкг/мл

0,20 ± 0,008

0,29 ± 0,004*

0,35 ± 0,003*

0,40 ± 0,005*

0,34 ± 0,006*»

0,42 ± 0,007*»

0,54 ± 0,010*»

Фибринолиз, мин

8,5 ± 0,03

9,1 ± 0,09

10,8 ± 0,06

12,3 ± 0,11

9,9 ± 0,09*

11,4 ± 0,11*

13,8 ± 0,09*

1

2

3

4

ТкТР, %

100 ± 2,9

80,3±1,2*

75,7±1,9*

69,3±2,2*

72,3±1,2*»

65,3±1,5*»

54,3±1,8*»

ДК, мг ЛП

0,051 ± 0,002

0,067 ± 0,006*

0,067 ± 0,006*

0,067 ± 0,006*

0,073 ± 0,008*»

0,088 ± 0,006*»

0,093 ± 0,009*»

ТБК, ед,/мг ЛП

0,70 ± 0,03

0,85 ± 0,04*

0,85 ± 0,04*

0,85 ± 0,04*

0,93 ± 0,03*»

1,53 ± 0,04*»

1,70 ± 0,06*»

ПИ, мин/мл

45,7 ± 1,1

34,3 ± 1,1*

34,3 ± 1,1*

34,3 ± 1,1*

27,3 ± 1,0*»

29,8 ± 1,1*»

32,4 ± 1,2*»

СО, мм3/мл/мин

0,75 ± 0,02

0,87 ± 0,05*

0,87 ± 0,05*

0,87 ± 0,05*

1,26 ± 0,08*»

1,44 ± 0,09*»

1,97 ± 0,10*»

Во 2-й группе опытов изучали влияние ХЛ на те же показатели, увеличивая дозу КБ в рационе и длительность опыта (6 и 8 недель крысы получали ХЛ в дозах 0,4; 0,6 или 0,8 г на особь в сут на фоне КБ в дозах, превышающих суточную потребность в 2, 8 или 16 раз).

И в этом случае подтвердилось свойство ХЛ ускорять НВСК - достоверно вырос уровень в плазме маркеров НВСК и выявилось, что введение КБ при всех испытанных дозах ХЛ ограничивает эффекты липида на НВСК и ТкТР, а фибринолиз активируется при 8- и 16-кратной дозе КБ. Скорость ЛПО под влиянием КБ уменьшалась, а АОП возрастал.

Заключая, выделим основные положения:

1. Высокие дозы ХЛ в полноценном рационе ускоряют НВСК до степени, которую можно рассматривать как начальную стадию ДВС крови.

2. Избыток КБ в дозах, адекватных малым лечебным, ограничивает эти сдвиги, а в дозах, адекватных высоким лечебным, усиливает их, и независимо от дозы ограничивает вызываемое введением холестерола снижение толерантности к тромбину.

3. Сдвигам скорости НВСК при гиперхолестеринемии сопутствуют ускорение ЛПО, снижение антиоксидантного потенциала тромбоцитов и активация фибринолиза.

Рецензенты:

Ральченко И.В., д.б.н., профессор кафедры фармацевтической технологии и фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития России, г. Тюмен№

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биохимии ГБОУ ВПО «Челябинская медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 12.12.2012.