Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

Hydrolytic enzymes encoded in the genome of thermoalkaliphilic bacterium thermosyntropha lipolytica

Mardanov A.V. 1 Beletskiy A.V. 1 Ravin N.V. 1
1 Centre «Bioengineering» of the Russian academy of sciences
Термофильная анаэробная бактерия Thermosyntropha lipolytica, выделенная из щелочного озера Богория в Кении, способна расщеплять триглицериды и утилизировать жирные кислоты в симбиотическом синтрофном сообществе с метаногенными археями. В отсутствие симбионтов эта бактерия может сбраживать некоторые белковые субстраты. В результате определения полной нуклеотидной последовательности генома T. lipolytica идентифицирован набор гидролитических ферментов этой бактерии. Анализ аминокислотных последовательностей позволил идентифицировать ферменты, содержащие N-концевые сигнальные последовательности, которые могут обеспечивать секрецию из клетки в окружающую среду. Среди этих ферментов обнаружены протеазы различных типов, липазы и гликозил-гидролазы. Наличие этих секретируемых гидролаз объясняет способность T. lipolytica расти на белковых субстратах и липидах и свидетельствует о том, что эта бактерия может также обладать способностью использовать для роста и некоторые полисахариды. Идентифицированные гидролитические ферменты, активные при высокой температуре в щелочных условиях, перспективны для применения в промышленной биотехнологии.
Thermophylic anaerobic bacterium Thermosyntropha lipolytica, isolated from a soda Lake Bogoria, Kenya, is able to hydrolyse triglycerides and untilizeon the liberated fatty acids in a syntrophic symbiotic association with a methanogenic archaeon. In the absence of syntrophic partner this bacterium is able to grow by fermentation on some proteinaceous substrates. Upon sequencing of the complete genome of T. lipolytica we identified a set of hydrolytic enzymes of this bacterium. Analysis of predicted amino acid sequences allowed to identify enzymes containing N-terminal signal sequences responsible for secretion of these enzymes out of the cell to the external medium. Proteases of different families, lipases and glycosyl hydrolases were found among these secreted enzymes. The presence of secreted hydrolases of these classes could explain the ability of T. lipolytica to grow on proteinaceous substrates and lipids, and suggest that this bacterium may be able to utilize some polysaccharides. Identified hydrolytic enzymes, active at high temperatures under alkaline conditions, may be used in different areas of industrial biotechnology.
bacteria
genome
protease
lipase
thermoalkaliphile
1. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Kolosov P.M., Ravin N.V. Vydelenie i kharakteristika lipazy iz termoalkalofil’nojj bakterii Thermosyntropha lipolytica // Prikladnaja biokhimija i mikrobiologija. 2012. T.48, no. 4. pp. 376–382.
2. Antranikian G., Vorgias C.E., Bertoldo C. Extreme environments as a resource for microorganisms and novel biocatalysts // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2005 Vol. 96, pp. 219–262.
3. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S.J. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0 // J. Mol. Biol. 2004 Vol. 340(4), pp. 783–795.
4. Besemer J., Borodovsky M. GeneMark: web software for gene finding in prokaryotes, eukaryotes and viruses // Nucleic Acids Res. 2005 Vol. 33, pp. 451–454.
5. Gooday G. The ecology of chitin degradation. In: Marshall K. (ed) Advances in microbial ecology. 1990 Plenum Press, New York, pp. 387–430.
6. Karlsson M., Stenlid J. (2008) Evolution of family 18 glycoside hydrolases: diversity, domain structures and phylogenetic relationships // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2009 Vol. 16 (3–4), pp. 208–223.
7. Salameh M.A., Wiegel J. Purification and characterization of two highly thermophilic alkaline lipases from Thermosyntropha lipolytica // Appl. Environ. Microbiol. 2007 Vol. 73(23), pp. 7725–7731.
8. Schink B. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997 Vol. 61, pp. 262–280.
9. Svetlitshnyi V., Rainey F., Wiegel J. Thermosyntropha lipolytica gen. nov., sp. nov., a lipolytic, anaerobic, alkalitolerant, thermophilic bacterium utilizing short and long chain fatty acids in syntrophic coculture with a methanogenic archaeum // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. Vol. 46. pp. 1131–1137.

Объектом исследования является термофильная анаэробная бактерия Thermosyntropha lipolytica, которая была выделена из щелочного озера Богория в Кении [9]. Этот относящийся к порядку Clostridiales микроорганизм растет в широком диапазоне температур от 52 до 70 °С при щелочных значения pH (7,15–9,5). В чистой культуре эта бактерия может расти на различных белковых субстратах (дрожжевой экстракт, триптон, мясной экстракт и др.), а также кротонате [9]. Основным продуктом сбраживания этих субстратов является ацетат. Слабый рост наблюдался также на пирувате, рибозе и ксилозе [9]. Особенностью T. lypolitica является способность расщеплять триглицериды (напр. растительного масла) и утилизировать жирные кислоты при росте в синтрофном симбиотическом сообществе с метаногенной археей (род Methanobacterium). В природе синтрофный метаболизм является важной промежуточной стадией в анаэробной конверсии биополимеров, таких как полисахариды, белки и липиды до углекислого газа и метана [8]. В реакциях метаногенеза архея использует водород и поддерживает его концентрацию на очень низком уровне, делающим сбраживание жирных кислот энергетически выгодным для T. lipolytica [9]. Синтрофный рост на липидах обеспечивается за счет липаз, секретируемых из клетки в окружающую среду [7]. При росте в отсутствии синтрофного партнера липазы также синтезируются и секретируются из клетки, однако в этих условиях T. lipolytica не способна использовать жирные кислоты и, следовательно, расти на липидах.

Способность микроорганизма использовать в качестве субстратов для роста сложные полимерные субстраты (белки, липиды, полисахариды и др.), которые не могут транспортироваться в клетку без предварительного расщепления, определяется наличием у него соответствующих гидролитических ферментов, секретируемых из клетки в окружающую среду. Идентифицировать такие ферменты можно в результате выделения, очистки и биохимической характеристики «внеклеточных» белков с последующим определением N-концевой аминокислотной последовательности белка и кодирующего его гена. Однако, помимо сложности и трудоемкости этих операций, немаловажным является тот факт, что далеко не все ферментативные активности, закодированные в геноме, экспрессируются при лабораторном культивировании микроорганизма, и подавляющее большинство их остается неизвестным исследователям. В последнее десятилетие в мировой практике расширилось применение нового подхода к поиску ферментов – определение полной геномной последовательности микроорганизма, позволяющее идентифицировать не какой-то один, а большую часть его ферментов (в оптимальном варианте – все) в результате анализа нуклеотидной последовательности. Ферменты, кодируемые идентифицированными генами, могут быть затем клонированы и экспрессированы в стандартных бактериях-продуцентах, таких как Escherichia coli. Таким образом, анализ геномных данных позволяет предсказать пути метаболизма микроорганизма и потенциальные субстраты для его роста, неизвестные из результатов его микробиологической характеристики в лабораторных условиях.

Цель исследования: идентифицировать в результате расшифровки геномной последовательности и охарактеризовать биоинформационными методами секретируемые гидролитические ферменты, кодируемые геномом T. lipolytica.

Материалы и методы исследования

Штамм T. lipolytica был выделен В.А. Светличным из щелочного озера Богория в Кении [9] и предоставлен нам для проведения данной работы. Нуклеотидная последовательность генома этой бактерии была определена нами методом пиросеквенирования на геномном анализаторе GS FLX [1]. Поиск открытых рамок считывания, способных кодировать белки, осуществляли с помощью программы GeneMark [4]. Для предсказания функций белков соответствующие аминокислотные последовательности сравнивали с базой данных NCBI с помощью BLASTP. Анализ аминокислотных последовательностей белков с целью идентификации N-концевых сигнальных последовательностей проводили с помощью программы SignalP v. 3.0 для грамположительных бактерий [3].

Результаты исследования и их обсуждение

Поиск гомологов белковых продуктов, предсказанных открытых рамок считывания, кодируемых в геномных последовательностях T. lipolytica по базе данных NCBI позволил идентифицировать гидролитические ферменты различных классов. Для изучения путей метаболизма T. lipolytica и возможности использования этой бактерией различных полимерных субстратов интерес представляют ферменты, секретируемые из клетки в окружающую среду. Для поиска таких ферментов с использованием программы SignalP 3.0 был проведен анализ того, содержат ли аминокислотные последовательности кодируемых белков N-концевые сигнальные последовательности, необходимые для секреции из клетки. Список гидролитических ферментов, в которых были идентифицированы такие сигнальные последовательности, приведен в таблице.

Наибольшую долю среди потенциально секретируемых гидролаз составляют протеолитические ферменты различных типов, что согласуется с возможностью роста T. lipolytica на белковых субстратах. Отметим, что не все пептидазы, содержащие сигнальные пептиды, обязательно участвуют в деградации присутствующих в среде белков, некоторые из них могут обеспечивать процессинг собственных белков клетки.

В гидролизе внеклеточных белков, вероятно, ключевую роль играет продукт гена 1588, Tlip_1588. Этот фермент является сериновой протеазой семейства S8/S53, аналогом субтилизина. Его гомологи кодируются в геномах многих протеолитических термофильных бактерий и архей (напр. пиролизин в Pyrococcus furiosus DSM3638), некоторые их них функционально охарактеризованы. Ближайшие гомологи Tlip_1588 найдены в геномах родственных T. lipolytica термофильных фирмикут родов Thermaerobacter, Thermincola и Tepidanaerobacter. Аминокислотная последовательность протеазы Tlip_1588 содержит три копии SLH домена (S-layer domain, pfam00395) в N-концевой области и каталитический домен первого субсемейства пептидаз семейства S8 (Peptidase S8 family domain, subfamily 1). Многие функционально охарактеризованные гомологи Tlip_1588 активны при высоких температурах в присутствии денатурирующих агентов [2] и рассматриваются в качестве перспективных ферментов для биотехнологического применения.

Важную роль в гидролизе белковых субстратов вне клетки может также играть Tlip_1807. Это сериновая протеаза, относящаяся к трипсиноподобным ферментам. Она содержит С-концевой PDZ домен, вовлеченный в белок-белковые взаимодействия и обеспечивающий распознавание субстрата. Аналогичную доменную структуру («трипсиновый» домен и PZD домен) имеет трипсиноподобная протеаза Tlip_2148.

Гидролитические ферменты T. lipolytica, содержащие N-концевые сигнальные последовательности

Ген

Предсказанная функция белка

Размер белка (а.о.)

Длина сигнального пептида (а.о.)

Вероятность наличия сигнального пептида

Протеолитические ферменты

68

Пептидаза семейства М23В

385

32

1.000

69

Серинования пептидаза семейства S41, процессируящая С-конец белков

372

23

0.915

292

Пептидаза семейства М23В

287

26

0.997

1204

Карбоксипептидаза семейства М14

466

26

1.000

1317

Сигнальная пептидаза, сериновая пептидаза семейства S49 (класс ClpP)

298

28

0.999

1588

Сериновая протеаза семейства S8/S53

1051

26

1.000

1728

Карбоксипептидаза серинового типа

376

31

0.981

1807

Сериновая протеаза, трипсин

359

24

0.966

2037

Пептидаза семейства М50

237

38

1.000

2038

Металлоэндопептидаза

190

28

0.999

2148

Пептидаза семейства S1/S6, хемотрипсин

382

45

0.861

2235

Пептидаза семейства M48

311

39

0.640

2258

Карбоксипептидаза серинового типа

384

30

1.000

Липолитические ферменты

786

Липаза

478

28

1.000

1200

Липаза

523

31

0.999

Ферменты, участвующие в гидролизе полисахаридов

937

Гликозил гидролаза семейства GH18

270

25

1.000

1727

Полисахарид деацетилаза

242

30

0.818

2341

Полисахарид деацетилаза

247

36

0.998

Функции остальных протеаз, последовательности которых содержат сигнальные пептиды, либо неясны, либо связаны с клеточным метаболизмом. Так, Tlip_0069 относится к С-концевым пептидазам, которые участвуют в деградации некорректно синтезированных белков и защите от теплового и осмотического стресса. Tlip_1204 – карбоксипептидаза семейства М14, гомологичные ей ферменты участвуют в процессах споруляции. Tlip_1317 – сингнальная пептидаза, обеспечивающая процессинг сигнальных пептидов. Tlip_2037 – металлопротеаза семейства М50, представители которого также принимают участие в споруляции.

Внеклеточный гидролиз липидов по всей вероятности обеспечивается двумя липазами, кодируемыми генами Tlip_0788 и Tlip_1200. Ранее из T. lipolytica были выделены и функционально охарактеризованы две липазы, проявлявшие максимум активности при температуре около 96 °С и рН 9,5 [7], однако соответствующие гены не были идентифицированы. Недавно мы клонировали, экспрессировали в E. coli и функционально охарактеризовали рекомбинантную липазу, являющуюся продуктом гена Tlip_0788 [1]. Было установлено, что эта липаза способна осуществлять гидролиз триацилглицеридов, в том числе растительных масел, на которых T. lipolytica способна расти в ассоциации с метаногенными археями.

Лишь три «внеклеточных» фермента могут принимать участие в процессах утилизации полисахаридов. Это гликозил-гидролаза семейства GH18, включающего хитиназы II типа [6], и две полисахарид деацетилазы, возможно, обладающие хитин-деацетилазной активностью. Возможность роста T. lipolytica на хитине не была исследована, однако известно, что этот полимер в больших количествах имеется в содовых озерах, являясь компонентом панциря обитающих в них креветок рода Artemia [5]. Отсутствие других секретируемых гликозил-гидролаз согласуется с неспособностью T. lipolytica расти на полисахаридных субстратах [9].

Выводы

Геном термоалкалофильной бактерии T. lipolytica кодирует набор гидролитических ферментов, которые могут секретироваться из клетки в окружающую среду. Идентифицированные протеазы различных типов и липазы обеспечивают использование T. lipolytica белковых субстратов и липидов соответственно. Идентифицированные гидролитические ферменты, активные при высокой температуре в щелочных условиях, перспективны для применения в промышленной биотехнологии.

Работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы, государственный контракт П479).

Рецензенты:

Бонч-Осмоловская Е.А., д.б.н., зам. директора по научной работе ФГБУН Института микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, г. Москва;

Замчук Л.А., д.б.н., ведущий научный сотрудник ФГБУН Центра «Биоинженерия» Российской академии наук, г. Москва.

Работа поступила в редакцию 07.11.2012.