В практике судебно-медицинского эксперта одним из актуальных вопросов в помощи правоохранительным органам является установление давности причинения механической травмы. Для решения данного вопроса в настоящее время существуют, как правило, только морфологические маркеры. Суть данных методов сводится к оценке процессов воспаления гистологическими методами [2]. Из биохимических же методов активно применяется определение концентрации метгемоглобина в гематомах. Однако данный метод абсолютно не приемлем при отсутствии данного патологического очага.
Механическая травма однозначно приводит к воспалительной реакции в организме [4], что не может не сказаться на состоянии перекисного окисления липидов (ПОЛ) – раннего маркера воспалительного процесса [5]. Однако в доступной научной литературе нами не обнаружено сведений, свидетельствующих о процессе перекисного окисления липидов при механической травме. Поэтому целью настоящей работы явилось исследование интенсивности свободно-радикального окисления липидов при механической травме для оценки возможности решения одной из актуальных задач судебно-медицинской экспертизы – установления давности причинения механических повреждений.
Материал и методы исследования
В качестве экспериментальных животных использовались беспородные крысы (самцы) массой 250–300 г. Животные содержались в стандартных клетках в условиях 12-часового режима освещения и свободного доступа к корму и воде. Содержание животных соответствовало санитарным правилам, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Кормили животных натуральными и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. Перед началом эксперимента животные проходили карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение 10 дней.
Животные были рандомизированы в одну из трех групп по 16 особей в каждой (всего 48 животных).
I группа (контроль) – контрольная (интактные животные).
II группа (опытная группа) – животные, которым формировали закрытый перелом костей голени и через сутки выводили из эксперимента.
III группа (опытная группа) – животные, которым формировали закрытый перелом костей голени и выводили из эксперимента через 2 недели.
Биохимические показатели оценивали в плазме крови и гемолизате.
Содержание продуктов ПОЛ – диеновых конъюгатов (ДК) и шиффовых оснований (ШО) определяли методами [7, 8]. Также определяли концентрацию гемоглобина в гемолизате, общих липидов [9], общего белка [10], активность ферментов: супероксиддисмутазы (СОД) и супероксидустраняющей активности (СУА) [6], каталазы [1].
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов прикладных программ «Microsoft Office 2007» (MS Excel 2007) и «Биостатистика» (версия 4.03).
Оценку соответствия типа распределения выборки нормальному проводили с использованием метода «трех сигм». Для каждой серии опытов рассчитывали медиану, процентили (25; 75 – нижнюю и верхнюю квартиль).
В случаях ненормального распределения для оценки статистически значимых различий между сравниваемыми группами использовали непараметрический двухвыборочный критерий Манна‒Уитни при уровне значимости p ≤ 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Содержание ДК в плазме крови опытных животных через сутки после сформированного перелома увеличивалось почти в 4 раза, в то время как спустя 2 недели данный показатель был снижен на 41 % (табл. 1).
Таблица 1
Содержание продуктов перекисного окисления липидов в крови крыс при экспериментальной травме опорно-двигательного аппарата
|
Группы животных |
I |
II |
III |
I |
II |
III |
||
|
Исследуемое соединение |
В гемолизате |
В плазме |
||||||
|
Диеновые коньюгаты, нмоль/мг липида |
Нормальность по 3σ |
No norm |
Norm |
Norm |
No norm |
Norm |
No norm |
|
|
Медиана |
9,28 |
14,76 |
7,06 |
4,90 |
19,28* |
2,89* |
||
|
25 процентиль |
4,24 |
8,86 |
5,51 |
3,13 |
13,81 |
2,54 |
||
|
75 процентиль |
11,96 |
25,16 |
12,36 |
5,86 |
31,66 |
2,99 |
||
|
Uкр p ≤ 0,05 |
не достоверно |
не достоверно |
31 |
81 |
||||
|
∆ % |
59 |
-24 |
294* |
- 41* |
||||
|
Шиффовые основания, условные единицы/мг липида |
Нормальность по 3σ |
Norm |
Norm |
Norm |
No norm |
No norm |
No norm |
|
|
Медиана |
13,00 |
58,24* |
13,79 |
3,95 |
24,88* |
2,53* |
||
|
25 процентиль |
3,96 |
24,39 |
6,59 |
2,95 |
17,01 |
2,27 |
||
|
75 процентиль |
26,49 |
79,24 |
18,61 |
4,82 |
36,36 |
3,38 |
||
|
Uкр p ≤ 0,05 |
31 |
не достоверно |
31 |
81 |
||||
|
∆ % |
348* |
6 |
530* |
-36* |
||||
Примечание: * p ≤ 0,05 – относительно контрольной группы.
Аналогичная динамика была выявлена и для ШО в плазме крови. Во II группе животных наблюдали увеличение данного показателя на 530 %, а в III группе животных снижение на 36 % соответственно (табл. 1).
Содержание ШО в гемолизате опытных животных через сутки после сформированного перелома увеличивалось на 348 % (табл. 1).
Достоверных отличий изменения активности СОД в гемолизате животных в экспериментальных группах по отношению к контролю не было выявлено. В то время как в плазме крови животных II группы отмечали повышение супероксидустраняющей активности на 135 % (табл. 2).
Таблица 2
Изменение активности ферментов-антиоксидантов в крови крыс при экспериментальной травме опорно-двигательного аппарата
|
Группы животных |
I |
II |
III |
I |
II |
III |
|
|
Исследуемое соединение |
В гемолизате |
В плазме |
|||||
|
Активность супероксиддисмутазы, условные единицы/мг гемоглобина (или условные единицы /мг белка) |
Нормальность по 3σ |
Norm |
Norm |
Norm |
No norm |
norm |
No norm |
|
Медиана |
1,21 |
1,64 |
1,05 |
0,2 |
0,47* |
0,34 |
|
|
25 процентиль |
0,62 |
1,36 |
0,85 |
0,07 |
0,44 |
0,15 |
|
|
75 процентиль |
1,60 |
1,96 |
2,10 |
0,40 |
0,51 |
0,49 |
|
|
Uкр p ≤ 0,05 |
не достоверно |
не достоверно |
24 |
не достоверно |
|||
|
∆ % |
35 |
-13 |
135* |
70 |
|||
|
Активность каталазы, нмоль перекиси водорода/мг гемоглобина (нмоль перекиси водорода /мг белка) |
Нормальность по 3σ |
No norm |
Norm |
No norm |
No norm |
No norm |
Norm |
|
Медиана |
87 |
144,77* |
100,99 |
3,81 |
6,15 |
4,17 |
|
|
25 процентиль |
76,62 |
135,79 |
97,86 |
1,25 |
5,57 |
1,93 |
|
|
75 процентиль |
113,11 |
146,77 |
106,22 |
6,26 |
6,63 |
5,10 |
|
|
Uкр p ≤ 0,05 |
31 |
не достоверно |
не достоверно |
не достоверно |
|||
|
∆ % |
66* |
16 |
61 |
9 |
|||
Примечание: * p ≤ 0,05 – относительно контрольной группы.
Изменение активности каталазы наблюдали только в гемолизате II группы животных. Активность фермента увеличилась на 66 % (табл. 2).
Полученные результаты показали, что на первые сутки после сформированного перелома происходит значительное увеличение продуктов ПОЛ (ДК и ШО) на фоне активации ключевых ферментов антиоксидантной защиты (каталазы и супероксидустраняющей активности). Это позволяет нам судить о формировании окислительного стресса через сутки после сформированного перелома.
Стоит заметить, что каталаза принадлежит к классу ферментов, активность которых увеличивается только в присутствии высоких концентрации перекиси водорода [3].
Через две недели после формирования перелома содержание продуктов ПОЛ (ДК и ШО) не только нормализуется, но и снижается по отношению к контрольной группе животных. Таким образом, мобилизация антиоксидантной системы организма приводит к нормализации свободнорадикального окисления липидов.
Заключение
Таким образом, полученные результаты позволяют прийти к выводу о возможности использования сведений о концентрации продуктов ПОЛ (ДК и ШО) для экспертного решения вопроса об установлении давности причинения механических повреждений. В дальнейшем предполагается детально проследить динамику развития окислительного стресса с последующим изучением этих показателей у лиц с травматической болезнью.
Рецензенты:
Бондаренко Т.И., д.б.н., профессор кафедры биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет», г. Ростов-на-Дону;
Шкурат Т.П., д.б.н., профессор кафедры генетики ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет», директор Научно-исследовательского института биологии ЮФУ, г. Ростов-на-Дону.
Работа поступила в редакцию 07.11.2012.