Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Бесплодие является одной из важнейших проблем в гинекологии и относится к тяжелым состояниям, нарушающим социальную и психологическую адаптацию женщины, влияющим на здоровье и качество жизни. Удельный вес женской инфертильности колеблется в пределах 60-70%. Этиология женского бесплодия весьма разнообразна и мало изучена. Ассоциация эндометриоза с бесплодием отмечается многими исследователями, изучающими данную проблему [1, 2, 7, 8].

По данным отечественных и зарубежных ученых, бесплодие при эндометриозе встречается в 30-60% случаев и является одним из основных симптомов проявления данной патологии [2, 8]. В то же время в обзорах, обобщающих данные о взаимоотношении бесплодия и эндометриоза за последние годы, так и не был дан ответ на вопрос: имеют ли эти состояния четкую причинно-следственную, патогенетически обусловленную связь между собой?

Несмотря на важность проблемы и большое количество предположений, однозначного и удовлетворительного объяснения увеличения частоты бесплодия у пациенток с эндометриозом до сих пор не существует. Кроме того, частота наступления беременности у женщин с бесплодием, ассоциированным с эндометриозом, после проведения курса лечения не превышает 30-33% [4, 11], что требует углубления исследований и поиска новых стратегий, направленных на повышение эффективности лечения.

В патогенезе генитального эндометриоза важная роль принадлежит нарушениям иммунного гомеостаза, в том числе и генетически обусловленным, предрасполагающим к определенному ответу иммунной системы на формирование эндометриоидных гетеротопий, их инвазию и распространение. В последние годы большое внимание уделяется изучению роли цитокинов, контролирующих процессы апоптоза, пролиферации и дифференцировки, в механизмах формирования эндометриоидных очагов [3, 5, 6, 9, 10]. Методами молекулярной медицины установлено, что гены цитокинов характеризуются наличием одного или нескольких структурных полиморфизмов, которые оказывают влияние на функциональную активность или уровень экспрессии кодируемых белков [6]. В связи с этим цель настоящего исследования: провести анализ распределения полиморфных вариантов генов иммунорегуляторных цитокинов при бесплодии, ассоциированном с эндометриозом, с целью идентификации молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к данной патологии.

В программу исследования вошли 215 пациенток репродуктивного возраста от 23 до 37 лет (средний возраст 29,2 ± 2,4 года), которые были госпитализированы в гинекологическую клинику ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России в 2009-2012 гг. для выполнения лечебно-диагностической и оперативной лапароскопии и гистероскопии. Показанием к оперативному вмешательству явилось бесплодие. Основную группу составили 150 пациенток (70%) с эндометриозом, страдающие бесплодием. Диагноз эндометриоза был поставлен в результате осмотра брюшины и органов малого таза на наличие эндометриоидных очагов в ходе эндоскопических методов исследования, с последующим гистологическим подтверждением. Группа сравнения была сформирована из 65 пациенток (30%) с бесплодием различной этиологии, которым была выполнена диагностическая лапароскопия и исключен генитальный эндометриоз. Лапароскопию и гистероскопию выполняли по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «Karl Storz» (Германия).

У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор и использование крови для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром в день операции. Стабилизированные образцы крови хранили при -70°С до момента исследования. Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Исследование полиморфных участков генов цитокинов проводили с использованием аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР). Были исследованы четыре полиморфных варианта: G-308A гена фактора некроза опухолей-альфа (TNFA) и C-509T гена трансформирующего фактора роста-бета (TGFB), T-330G гена интерлейкина (IL)2 и С-590Т гена IL4, локализованные в промоторных участках генов и отвечающие за уровень экспрессии соответствующих цитокинов. Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе при использовании амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). После проведения ПЦР 8 мкл амплификата разделяли в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, при напряжении 150 B в течение нескольких мин для последующей визуализации в ультрафиолетовом свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим», Россия).

Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом и бесплодием сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах женщин, используя критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации разных генотипов и аллелей с заболеванием судили по величине отношения шансов (odds ratio (OR)) с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI).

В ходе проведенного нами исследования было установлено, что средняя продолжительность бесплодия у пациенток с эндометриозом составила 3,6 ± 1,1 лет, которое у 99 пациенток (66%) было первичным, а у 51 женщины (34%) оказалось вторичным. Кроме того, 111 женщин (74%) данной группы предъявляли жалобы на болевой синдром, 111 (74%) - на дисменорею, 57 (38%) - на диспареунию, 54 (36%) - на нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии.

Наиболее часто, в 86% случаев (у 129 пациенток), во время лапароскопии диагностировались малые формы эндометриоза, в то время как эндометриоидные кисты - в 64% (96 пациенток), из них двусторонние в 30% случаев. Частота ретроцервикального эндометриоза не превышала 14% (21 пациенток). У 87 больных (58%) в малом тазу был выявлен спаечный процесс различной степени выраженности. Чаще встречался умеренно выраженный спаечный процесс органов малого таза - I-II cтепень составила 71,3% (62 пациентки), II степень и IV степень составили соответственно 22,9 и 5,8% случаев.

Соответственно выявленной патологии, пациенткам проводилась лапароскопическая коррекция, направленная в первую очередь на максимальное удаление всех видимых и пальпируемых очагов эндометриоза и восстановление нормальных отношений органов малого таза - термокаутеризация очагов эндометриоза была выполнена 129 пациенткам (86%), разделение спаек - 90 (60%) и цистэктомия - 96 (64%).

В группе сравнения продолжительность бесплодия составила 2,5 ± 1,1 лет. Первичное бесплодие встречалось у 26 женщин (40%), вторичное - у 39 (60%). Основные жалобы, предъявляемые пациентками, распределились следующим образом: на наличие болевого синдрома указывали 13 пациенток (20%), дисменорею - 7 (10,8%), нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии - 7 (10,8%). Объем оперативного вмешательства для всех пациенток данной группы был одинаков и представлен гистероскопией и диагностической лапароскопией.

Одна из причин развития инфертильности при эндометриозе - дисбаланс в цитокиновой системе. В перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом и бесплодием значительно повышен уровень ингибитора миграции макрофагов, что способствует росту гетеротопий. Кроме того, сами гетеротопии секретируют специфические вещества, стимулирующие макрофагально-макроцитарную систему, в результате чего происходит изменение уровня цитокинов и факторов роста [9, 10, 12].

Функционирование цитокиновой сети при эндометриоз-ассоциированном бесплодии зависит от многих причин, в число которых входят индивидуальные различия в продукции иммунорегуляторных молекул, обусловленные рядом генетических особенностей [5, 6]. Гены цитокинов являются высококонсервативными структурами, в связи с чем мутации внутри экзонов редки и обусловливают изменение функций или вовсе отсутствие экспрессируемого белка. Консервативные мутации не затрагивают аминокислотную последовательность, однако могут влиять на экспрессию белка другими путями: изменяя сплайсинг или стабильность мРНК, влияя на уровень транскрипции исследуемого гена. Наиболее часто встречающиеся аллельные варианты генов цитокинов образуются в результате мутаций интронных областей, напрямую не изменяющих аминокислотную последовательность, но влияющие на продукцию белков [6].Структурные особенности белковых продуктов полиморфных участков генов цитокинов обусловливают дифференциацию иммунного ответа организма и определяют формирование эндометриоидных гетеротопий, их инвазию и распространение.

TNF-α - один из основных провоспалительных цитокинов. С одной стороны, он играет важную роль в регуляции нормальной дифференцировки, роста и метаболизма разных клеток, а с другой - выступает в роли медиатора патологических иммуновоспалительных процессов при различных заболеваниях человека [5, 6, 9, 10]. Известно, что ген TNFА локализован в кластере генов системы HLA, аллельный полиморфизм которых подробно изучен. Замена в позиции G-308Aгена TNFА влияет на изменение транскрипции и продукции TNF-α [6]. В ходе иммуногенетического исследования было выявлено,что среди пациенток с генитальным эндометриозом и бесплодием чаще встречаются носители генотипа АA (40,7%) полиморфного участка G-308Aгена TNFA. В группе женщин с бесплодием без эндометриоза достоверно чаще встречался гомозиготный по аллелю G генотип (61,5%). Сравнительная оценка распределения аллелей и генотипов исследуемого гена показала значимое увеличение частоты аллеля А и генотипов АА иGA у пациенток с генитальным эндометриозом и бесплодием (р = 0,0001) по сравнению с аналогичным показателем у женщин с бесплодием без данной патологии. Кроме того, была показана положительная ассоциация генотипов АА (OR = 1,61) и GA (OR = 2,31) полиморфизма G-308Aгена TNFA с генитальным эндометриозом, ассоциированным с бесплодием, - наличие данных генотипов увеличивает относительный риск развития эндометриоз-ассоциированного бесплодия (табл. 1).

Изучение транскрипционного контроля гена TGFB представляет особенный интерес в связи с тем, что этот цитокин является супрессорным фактором в отношении клеточного иммунного ответа - показано, что ТGF-β угнетает пролиферативный ответ Т-клеток, ингибирует секрецию супероксидных радикалов и оказывает негативное воздействие на функцию нейтрофилов и макрофагов, вызывая локальную иммуносупрессию [6, 10, 12]. Дальнейшее иммуногенетическое исследование показало, что у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием (48%) и пациенток с инфертильностью без данной патологии (56,9%) чаще встречался гомозиготный по аллелю С генотип полиморфизма C-509T гена TGFB. Обращало на себя внимание отсутствие статистически значимых различий в частотах распределения аллелей и генотипов изученного гена среди обследованных женщин с бесплодием как ассоциированным с эндометриозом, так и без такового (табл. 2).

Примечание. Здесь и в табл. 2-4: χ² - стандартный критерий Пирсона для сравнения частот генотипов и аллелей генов; OR - критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению с женщинами без эндометриоза с 95% доверительным интервалом.

Контроль транскрипции гена IL2 связан с промоторной зоной, где расположены участки связывания энхансеров транскрипции NFAT1, NF-κB, AP-1, erg-1. Все сайты, находящиеся в области промотора гена, необходимы для полноценной активации в ответ на TCR-зависимую стимуляцию лимфоцита. Установлено, что блокада экспрессии TNFA, являющегося важнейшим звеном сигнального пути регуляции экспрессии гена IL2, в Т-лимфоцитах сопровождается снижением активности промотора IL2 и угнетением синтеза цитокина. Полиморфизм T-330G гена IL2 расположен в промоторной области и влияет на уровень продукции кодируемого цитокина [5, 6, 9]. В ходе иммуногенетического исследования было установлено, что у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием (46,7%) и пациенток без данной патологии (53,8%) чаще встречался гомозиготный по аллелю T генотип полиморфизма T-330G гена IL2. Обращало на себя внимание статистически значимое увеличение частоты генотипа GG полиморфного участка T-330G гена IL2 среди женщин с бесплодием, ассоциированным с эндометриозом (χ² = 6,07; р = 0,05), относительно аналогичного показателя у женщин без эндометриоза.Кроме того, была показана положительная ассоциация генотипа GG (OR = 2,10) и аллеля G (OR = 1,62) полиморфного региона T-330G гена IL2 с бесплодием и эндометриозом (табл. 3).

Продукция IL-4 является индуцибельной, для активации транскрипции гена IL4 необходима активация протеинкиназы С и Са²⁺-кальмодулиновой системы, что в конечном итоге приводит к фосфорилированию белков семейства TNFAи связыванию их с регуляторной областью гена. Установлено, что наличие в промоторном регионе аллельного варианта - 590Т определяет более высокий уровень продукции IL-4 [5, 6, 12]. Исследование характера распределения аллелей и генотипов полиморфизма С-590Т промотора гена IL4 показало, что большая часть обследованных женщин являются носителями гомозиготного варианта СС полиморфного участка С-590Т гена IL4. Было отмечено также статистически значимое увеличение количества гомозигот по аллелю Т среди пациенток с эндометриоз-ассоциированным бесплодием (χ² = 10,17; р = 0,006) по сравнению с женщинами без данной патологии. Выявлена положительная ассоциация бесплодия и эндометриоза с аллелем Т (OR = 2,39), а также с генотипом ТТ (OR = 2,98) полиморфизма С-590Т гена IL4 (табл. 4).

Таблица 4 Распределение генотипов и аллелей полиморфизма С-590Т генаIL4 (%) среди обследованных женщин

Таким образом, распределение аллельных вариантов генов цитокинов среди пациенток с эндометриоз-ассоциированным бесплодием характеризуется доминированием генотипов АA полиморфного участка G-308A гена TNFA, TT полиморфизма C-509T гена TGFB, GG полиморфного локуса T-330G гена IL2 и TT полиморфного участка С-590Т гена IL4. Подверженность бесплодию и связанному с ним эндометриозу ассоциирована с АА и GA генотипами полиморфизма G-308A гена TNFA, G аллелем и GG генотипом полиморфного региона T-330G гена IL2, Т аллелем и ТТ генотипом полиморфизма С-590Т гена IL4.

В заключение необходимо отметить, что ключевой функцией иммунной системы является поддержание постоянства антигенной структуры, что подразумевает защиту от генетически модифицированных собственных антигенов, в частности от эндометриоидных гетеротопий. Взаимодействие участников иммунного ответа происходит путем обмена универсальными цитокиновыми сигналами. Нарушения в системе цитокинов необратимо влекут за собой невозможность кооперации и координации деятельности иммунной системы, что ведет к пролиферации и инвазии ткани, морфологически и функционально подобной эндометрию, за пределами слизистой оболочки полости матки. Неоспоримым является тот факт, что особенности реагирования организма генетически детерминированы. Установленные нами изменения соотношения в распределении аллельных вариантов промоторных участков генов цитокинов у обследованных нами женщин могут обу­словливать функциональные нарушения, которые приводят к количественным изменениям протекания защитных реакций (но не к полному генетическому дефекту), что сказывается на развитии эндометриоза и ассоциированного с ним бесплодия.

• Агафонов В.И., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет», г. Томск;
• Сотникова Л.С., д.м.н., профессор кафедры акушерства и гинекологии ФПК и ППС патофизиологии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет», г. Томск.

Работа поступила в редакцию 03.09.2012.