В настоящее время оксидативный стресс считается ведущим фактором в развитии ряда патологических состояний. Его проявление выражается в нарушении динамического равновесия в системе прооксиданты-антиоксиданты в сторону свободно-радикального окисления, продукты которого обладают широким спектром повреждающего действия. Это приводит к окислительным модификациям биополимеров и, как следствие, к снижению стабильности и изменению физико-химических свойств мембран. Острое гипоксическое воздействие с последующей реоксигенацией, как правило, вызывает интенсивную генерацию активированных кислородных метаболитов, нарушения в ксантиноксидоредуктазной системе, катаболизме АТФ и глюкозы, а также недостаточность компонентов антиоксидантной системы. Однако какой из перечисленных источников является доминирующим, зависит от многих обстоятельств, в том числе режима гипоксии, реоксигенации, активности сигнальных систем, мощности и емкости антиоксидантной защиты, в значительной степени определяющих адаптационные возможности организма [6, 7].
Широкая представленность патологических состояний, включающих гипоксию разной этиологии, определяет актуальность поиска средств и методов повышения резистентности организма к гипоксии эндо- и экзогенного происхождения, путём постгипоксической коррекции метаболических сдвигов. Воздействовать на активность свободно-радикальных процессов и динамику равновесия системы прооксиданты-антиоксиданты возможно как при помощи фармакологических препаратов, так и при использовании немедикоментозных методов лечения. В ходе проведения ряда исследований было установлено, что импульсные токи, электрические и магнитные поля оказывают выраженный положительный биологический эффект при гипоксии [12]. Одним из методов немедикаментозного лечения является импульсное воздействие на чувствительные и поверхностные двигательные нервные проводники кожи сериями нейроподобных биполярных колебаний тока различной частоты, которые изменяются в зависимости от величины ёмкостного сопротивления тканей в зоне воздействия. В качестве сигнала электроимпульсного воздействия используется импульсный биполярный ток без постоянной составляю- щей - СКЭНАР воздействие [1, 2, 4].
Целью настоящей работы явилось комплексное исследование интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) по уровню его молекулярных продуктов: малонового диальдегида (МДА), шиффовых оснований (ШО), диеновых конъюгатов (ДК); оценка функционального состояния мембран эритроцитов по уровню суммарной пероксидазной активности (СПА) и изучение состояния антиоксидантной системы плазмы крови экспериментальных животных на примере ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в условиях физиологической нормы, при острой гипобарической гипоксии (ГПО), как типового патологического процесса, и на фоне постгипоксического СКЭНАР-воздействия.
Материалы и методы исследования
Лабораторные животные. Эксперименты проводили на белых крысах, самцах Rattus norvegicus массой 180-200 г в возрасте 9 месяцев. Животные содержались в пластиковых клетках при стандартном режиме освещения и температуры, имели доступ к стандартному лабораторному корму ad libitum.
Дизайн эксперимента. Все подопытные животные были разделены на 5 групп:
1-я группа (n = 10) - контроль - интактные животные.
2-я группа (n = 10) - крысы, подвергнутые действию гипобарической гипоксии. Извлечение биологического материала осуществляли спустя 5 мин после сеанса гипоксии.
3-я группа (n = 10) - крысы, подвергнутые действию гипобарической гипоксии. Извлечение биологического материала осуществляли через 24 часа после сеанса гипоксии.
4-я группа (n = 10) - крысы, которым проводили 2 сеанса СКЭНАР-воздействия: время проведения первого сеанса составляло 10 мин, второй сеанс проводили через 18 часов в течение 10 мин. Извлечение биологического материала осуществляли через 6 часов после 2 сеанса СКЭНАР-воздействия.
5-я группа (n = 10) - крысы, подвергнутые действию гипобарической гипоксии и СКЭНАР-воздействию, которое проводили дважды: первое в течение первого часа после гипоксии, второе через 18 часов после гипоксии. Извлечение биологического материала осуществляли через 6 часов после 2 сеанса СКЭНАР-воздействия.
Выбор срока извлечения биологического материала
Извлечение биологического материала осуществляли спустя 5 мин после сеанса гипоксии (2 группа) с целью установления наличия гипоксического состояния и окислительного стресса, сопровождающихся соответствующими изменениями биохимических показателей. Извлечение биологического материала осуществляли спустя 24 часа после сеанса гипоксии (3 группа) с целью анализа динамики изменений биохимических показателей, после проведения контролируемой гипобарии. Исследование биоматериала у крыс 5 группы также проводилось спустя 24 часа после сеанса гипобарической гипоксии на фоне коррекции СКЭНАР-воздействием, с целью выявления влияния электроимпульсной терапии на восстановление биохимических показателей.
Моделирование гипоксии. Сеанс гипоксии осуществляли в режиме 230 мм рт. ст. (9000 м над уровнем моря) в течение 180 минут. Подопытные животные помещались в барокамеру объемом 10 л, снабженную щелочным поглотителем углекислоты. Декомпрессию и компрессию проводили в течение 15 мин. Изопрессия составляла 150 минут.
Методика проведения СКЭНАР-воздействия. Животные 3 и 4 группы получали сеансы СКЭНАР-воздействия с помощью аппарата «СКЭНАР-1 НТ» (ОКБ «Ритм», г. Таганрог) контактной стабильной методикой на эпилированную кожу в области позвоночника в режиме SW3, продолжительностью 10 мин.
Извлечение биологического материала. Кровь декапитированных экспериментальных животных собирали самотёком в стеклянные центрифужные пробирки с добавлением раствора гепарина из расчёта 25 ед./мл и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин для получения плазмы.
Определение биохимических показателей. Определение уровней глюкозы, молочной кислоты и мочевой кислоты в плазме крови осуществляли с помощью коммерческих наборов реагентов: «Глюкоза GOD-PAP» НПФ «АБРИС+», «Молочная кислота» НПФ «АБРИС+», «Мочевая кислота UR-PAP» НПФ «АБРИС+». Концентрацию пировиноградной кислоты (ПВК) определяли с помощью коммерческого набора «Ольвекс». Количественное определение ксантина проводили микрометодом Williams (1950) в цельной крови в модификации Погореловой и соавт. (1983) [9]. Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли в хлороформном экстракте по поглощению УФ света при длине волны 233 нм по Стальной (1977) [11]. Концентрацию шиффовых оснований определяли в хлороформном экстракте флуориметрическим методом при длине возбуждения 360 нм и длине эмиссии 440 нм по Bidlack (1973) [13]. Хлороформный экстракт готовили по методу Bligh и Dyer (1959) [14]. Уровень малонового диальдегида (МДА) оценивали по реакции с тиобарбитуровой кислотой по Стальной и Гаришвили (1977) [10]. Активность супероксиддисмутазы СОД оценивали по ингибированию восстановления нитросинего теразолия (НТС) супероксидом, генерируемым при аутоокислении адреналина по Сироте (1999) [10]. Активность каталазы определяли по реакции перекиси водорода с молибдатом аммония по Королюк (1988) [3]. Определение активности ксантиноксидазы (КО) проводили спектрофотометрически в гомогенатах печени крыс по методу W. Kaminski и M. Jezewska (1979) [15]. Суммарную пероксидазную активность СПА оценивали по модифицированному бензидиновому методу [5]. Концентрацию белка в плазме крови определяли методом Лоури (1951). Содержание липидов в хлороформном экстракте определяли по реакции с фосфорнованилиновым реактивом с помощью коммерческого набора производства «Lachema» (Чехия).
Приборная база. Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре DU 800, «Beckman Coulter» (США), спектрофлуориметрические исследования проводили на спектрофлуориметре RF-5301 C «Shimadzu» (Япония), анализ некоторых биохимических показателей осуществляли на автоматическом биохимическом анализаторе «Сапфир 400» (Hirose Electronic Systems, Япония).
Статистическая обработка. Статистическую обработку биохимических данных проводили по методу Монцевичуте-Эрингене (1964). Достоверность полученных различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и пакета программ «Statistica 6.0».
Результаты исследования и их обсуждение
Интенсивность метаболических изменений, происходящих при острой гипобарической гипоксии на уровне энергетического и углеводного обмена, оценивали по содержанию глюкозы, лактата и пирувата в плазме крови крыс. После сеанса гипобарической гипоксии было выявлено достоверное увеличение концентрации лактата на 34%, пирувата на 74% от соответствующих значений контроля. Концентрация глюкозы по сравнению с контролем снизилось незначительно, отношение лактат/пируват выросло в среднем на 32% (см. рис. 1). Полученные результаты свидетельствуют о развитии метаболических нарушений, связанных с быстрым истощением свободного пула глюкозы в плазме крови. Увеличение содержание лактата на фоне отставания роста концентрации пирувата, а также возросшее отношение лактат/пируват свидетельствует о резком усилении процессов анаэробного гликолиза, на фоне общего замедления окислительных процессов, и затруднении энергозависимых процессов ресинтеза гликогена из молочной кислоты.
Концентрация глюкозы в крови декапитированных крыс 3-й группы спустя сутки после завершения сеанса гипобарической гипоксии стала приближаться к нормальным значениям, тогда как содержание пирувата и лактата все еще превышало уровень физиологических величин на 56 и 30% соответственно. Уровень глюкозы, пирувата и лактата в плазме крови животных 4-й группы, подверженных 2-кратному СКЭНАР-воз- действию, статистически достоверно не изменились по сравнению с контрольными показателями.
Рис. 1. Изменение некоторых показателей углеводного обмена (глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат/пируват) в плазме крови крыс при оксидативном стрессе, вызванном острой гипоксией, и СКЭНАР-воздействии в% по отношению к контролю - 1 группа животных. * - достоверные отличия при р < 0,05
Было отмечено ослабленное течение гипоксии для животных 5-й группы, подвергнутых коррекции СКЭНАР-воздействием дважды непосредственно после сеанса гипоксии и спустя 18 часов, что выразилось в изменении уровней ПВК и лактата на 54, ‒6% соответственно.
Уровень ксантина и мочевой кислоты в плазме крови животных, подвергнутых гипоксии достоверно увеличился на 28 и 45% в соответствии с физиологической нормой (рис. 2).
Очевидно гипоксическое повреждение тканей индуцирует разрушение нуклеиновых кислот, что сопровождается образованием пуриновых оснований, с последующей их модификацией в ксантин. Эти процессы носят ярко выраженный характер, а высокие значения ксантина в плазме крови свидетельствуют о развитии острой гипоксии как на уровне клеток, так и всего организма. Накопление ксантина, в свою очередь, индуцирует работу прооксидантного фермента ксантиоксидазы (КО). Активность КО в группе животных, подвергнутых гипоксии, достоверно увеличилась на 66%. Развитие гипоксического синдрома способствует переходу ксантиноксидоредуктазной системы из ксантиндегидрогеназной формы активности в ксантиноксидазную, а усиление сдвига равновесия НАДН/НАД+ дополнительно усиливает процессы ПОЛ. Концентрация мочевой кислоты в плазме крови крыс, прошедших постгипоксическую коррекцию СКЭНАР-воздействием после гипобарической гипоксии, снизилось на 9%, по отношению к 3-й группе животных. Падение ферментативной активности ксантиноксидазы в 1,5 раза по сравнению с активностью ксантиноксидазы у животных 3-й группы отражает наличие положительной динамики СКЭНАР-воздействия на стабилизацию процессов системы пуринового обмена.
Рис. 2. Изменение показателей системы пуринового обмена (ксантина, мочевой кислоты и активности ксантиноксидазы) в плазме крови крыс при оксидативном стрессе, вызванном острой гипоксией, и СКЭНАР-воздействии в % по отношению к контролю ‒ 1 группа животных. * - достоверные отличия при р < 0,05
Действие гипоксии, соответствующей высоте 9000 м над уровнем моря в течение 3 часов, способствовало активизации и ПОЛ, выразившейся в достоверном накоплении первичных (ДК), вторичных (МДА) и конечных (ШО) продуктов окисления липидов в плазме крови (рис. 3).
Рис. 3. Изменение содержания продуктов ПОЛ (диеновых конъюгат (ДК), шиффовых оснований (ШО), малонового диальдегида (МДА) в плазме крыс при оксидативном стрессе, вызванном острой гипоксией, и СКЭНАР-воздействии в % по отношению к контролю - 1 группа животных. * - достоверные отличия при р < 0,05
Содержание как начальных, так и конечных продуктов окисления липидов (МДА, ДК, ШО) в плазме крови крыс непосредственно после гипоксии превысило нормальные показатели на 27, 36, и 18% соответственно. Повышенный уровень продуктов окисления липидов сохранялись в плазме крови крыс и спустя 24 часа после действия гипоксии. СКЭНАР-воздействие на интактных животных способствовало достоверному снижению содержания диеновых коньюгат (ДК) на 15%, тогда как содержание МДА и ШО статистически достоверно не изменялись. У животных, подвергнутых коррекции СКЭНАР-воздействием уровень продуктов ПОЛ статистически достоверно ниже для МДА и ДК в 1,37 и 1,24 раза соответственно.
В условиях гипоксического синдрома происходит дисбаланс физиологического оксидант-антиоксидантного равновесия, что подтверждается инактивацией каталазы и СОД на 35 и 42% соответственно. В случае постгипоксической коррекции СКЭНАРом уровень каталазы и СОД в плазме изменяется на 11 и 29% (рис. 4).
Рис. 4. Изменение активности СПА, СОД и каталазы в плазме крови крыс при оксидативном стрессе, вызванном острой гипоксией, и СКЭНАР-воздействии в % по отношению к контролю ‒
1 группа животных. * - достоверные отличия при р < 0,05
Следствием усиления ПОЛ и изменения структурных свойств эритроцитарных мембран является их дестабилизация и нарушение барьерных функций. Для оценки функционального состояния мембран форменных элементов крови после воздействия гипоксией были определены в плазме крови суммарная пероксидазная активность (СПА). У крыс, подвергнутых гипоксическому оксидативному стрессу, по сравнению с контрольной 1-й группой, уровень СПА достоверно возрос на 43% и оставался повышенным еще в течение 24 часов (см. рис. 4). Проведение постгипоксической коррекции СКЭНАРом способствовалоснижению СПА на 16%, по сравнению с 3-й группой.
Обсуждая пусковые механизмы антиоксидантного эффектов СКЭНАР-воздействия, можно предположить его активирующее влияние на гены раннего реагирования. Установлено, что индукция ранних генов в клетках происходит при целом ряде воздействий, в том числе при действии электрокожных раздражителей [16]. Можно предположить, что СКЭНАР, являясь электроимпульсным низкоинтенсивным нейроподобным воздействием с обратной связью, активирует ранние гены, которые осуществляют избирательную транскрипцию генома, направленную на запуск каскада защитно-адаптивных реакций, приводящих к активации антиоксидантной системы, что способствует снижению интенсивности окислительного стресса.
Заключение
Обменные процессы у крыс в остром периоде гипоксического синдрома характеризуются активизацией свободно-радикального окисления и изменением метаболизма углеводов, направленным на восстановление энергетического баланса клеток и тканей в условиях резкого дефицита кислорода за счёт альтернативного синтеза АТФ путём субстратного фосфорилирования. Непосредственно после сеанса гипоксии в плаз- ме крови регистрируются изменения, характерные для гипоксических поражений - подавление активности ферментов антиоксидантной защиты, активация гликогенолиза, сопровождающегося накоплением продуктов распада глюкозы - лактата и пирувата. Происходит интенсификация ПОЛ с накоплением конечных продуктов - МДА, ДК и ШО. При проведении постгипоксической коррекции СКЭНАРом отмечено влияние электроимпульсной терапии на восстановление биохимических показателей, таких как лактат, МДА, ДК, активности ферментов каталазы и СОД.
Рецензенты:
-
Друккер Н.А., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник отдела медико-биологических проблем в акушерстве и педиатрии ФГБУ «Ростовский НИИ Акушерства и педиатрии» Минздравсоцразвития РФ, г. Ростов-на-Дону;
-
Горошинская И.А., д.б.н., профессор, руководитель биохимической лаборатории ФГБУ «Ростовский Научно-исследовательский онкологический институт» Минздравсоцразвития России, г. Ростов-на-Дону;
-
Щуковский В.В., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела инновационных проектов в нейрохирургии и вертебрологии ФГБУ «СарНИИТО», г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 20.04.2012.