Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

THE STUDY OF ACUTE TOXICITY AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF THE DRY EXTRACT OF LEAVES OF POPULUS TREMULA L.

Lobanova I.Yu. 1 Turetskova V.F. 1 Zverev Ya.F. 1 Talalaeva O.S. 1
1 Altay State Medical University, Barnaul
Проведено исследование острой токсичности и антиоксидантной активности экстракта листьев осины сухого. При энтеральном введении крысам и мышам в дозах от 2500 мг/кг до 10000 мг/кг острой токсичности не выявлено, гибель животных отсутствовала, что не позволило установить летальную дозу экстракта (LD50). В связи с чем, изучаемый препарат может быть отнесен согласно ГОСТ 12.1.007-76 к IV классу опасности (малоопасные вещества). В экспериментах in vitro установлены высокая антиоксидантная (67,01,12%) и низкая прооксидантная (25,11,68%) активности исследуемого экстракта. Полученные данные свидетельствует о том, что биологически активные вещества экстракта способны подавлять процессы пероксидации, выступая в роли прямого антиоксиданта, и не обладают способностью прямо индуцировать перекисное окисление липидов клеточных мембран.
The investigation of acute toxicity and antioxidant activity of the dry extract of leaves of aspen ordinary (Populus tremula L.) has been conducted. Acute toxicity has been not revealed after intragastric introduction to rats and mice in doses from 2500 mg/kg to 10000 mg/kg. Death of the animals has not been observed that did not allow to establish a lethal dose of the extract (LD50). In this connection, the studied preparation may be classified to Substance Hazard Class IV (low hazard substances) in compliance with State Standard GOST 12.1.007-76. High antioxidant (67,01,12%) and low prooxidant (25,11,68%) activity of the extract has been determined in the experiments in vitro. The obtained data indicate that biologically active substances of the extract being a direct antioxidant can suppress processes of peroxidation, and they don´t have an ability to induce lipid peroxidation of cell membranes directly.
aspen ordinary (Populus tremula L.)
dry extract
acute toxicity
antioxidant activity
prooxidant activity
1. Belen'kiy M.L. Elementy kolichestvennoj otsenki farmakologicheskogo effekta [Elements of quantitative estimation of a pharmacological effect]. Leningrad: Medgiz, 1963. 152 p.
2. Golovkin B.N. Biologicheski aktivnye veschestva rastitel'nogo proiskhozhdeniya [Biologically active substances of phytogenous]. Moscow: Nauka. In 3 t. 2001.
3. Gosudarstvennyj standart 12.1.007-76. Vrednye veschestva. Klassifikatsiya i obschie trebovaniya bezopasnosti [State Standard (GOST) 12.1.007-76. Harmful substances. Classification and the general requirements of safety]. 2 p.
4. Il'ina E.I. Turetskova V.F., Lobanova I.Yu. Izuchenie sostava fenol'nykh soedinenij ekstrakta list'ev osiny sukhogo. Aktual'nye problemy farmakologii i farmatsii: Sb. nauch. statej [The study of phenolic compounds of the dry extract of leaves of Populus tremula L. Actual problems of pharmacology and pharmacy: collected scientific articles]. Issue VII. Barnaul, 2010. pp. 74-81.
5. K'osev P.A. Polnyj spravochnik lekarstvennykh rastenij [Complete manual of medicinal plants]. Moscow: EKSMO, 2002. 992 p.
6. Lobanova I.Yu. Vybor optimal'nykh parametrov faktorov, vliyayuschikh na protsess izvlecheniya biologicheski aktivnykh veshchestv iz list'ev osiny obyknovennoj. «Molodezh - Barnaulu»: materialy 11 gorodskoj nauchno-prakticheskoj konferentsii molodykh uchenykh (The youth - to Barnaul: materials of XI city scientifically-practical conference of young scientists (on November, 17-20th, 2009): in 2 t.). Otv. red. B.A. Chernichenko. Barnaul: Altajskij gos. univ., 2010. V. 2. pp. 119-120.
7. Lobanova I.Yu., Turetskova V.F. Izuchenie sostava osnovnykh biologicheski aktivnykh veshchestv gidrofil'noj fraktsii list'ev osiny obyknovennoj. 35 let farmatsevticheskomu fakul'tetu AGMU: itogi i perspektivy. Materialy nauchno-prakticheskoj konferentsii, posvyashchennoj 35-letiyu farmatsevticheskogo fakul'teta (35 years to pharmaceutical faculty ASMU: results and prospects. Materials of the scientific-practical conference dedicated to the 35th anniversary of the pharmaceutical faculty). Barnaul, 2010. pp. 82-88.
8. Mineeva T.N., Arbuzova Ya.S., Zverev Ya.F. Opredelenie antioksidantnoj i oksidantnoj aktivnosti in vitro vodnykh i spirtovykh izvlechenij iz list'ev zimoljubki zontichnoj, ortilii odnobokoj, grushanki kruglolistnoj. Aktual'nye problemy farmatsii: Sb. nauch. statej [The identification of antioxidant and oxidant activity in vitro of water and alcohol extracts from leaves of Chimaphila umbellate L., Orthília secunda L., Pyrola rotundifolia L. Actual problems of pharmacology and pharmacy: collected scientific articles.] Issue II. Barnaul, 2005. pp. 79-82.
9. Rukovodstvo po eksperimental'nomu (doklinicheskomu) izucheniyu novykh farmakologicheskikh veschestv [Experimental (preclinical) study of new pharmacological substances manual] / Pod redaktsiej R.U. Khabrieva. Moscow: Meditsina, 2005. 832 p.
10. Sokolov S.Ya., Zamotaev I.P. Spravochnik po lekarstvennym rasteniyam [Manual on medicinal plant]. Moscow: Metallurgiya, 1990. 427 p.
11. Shkarina E.I., Maksimova T.V., Nikulina I.N. O vliyanii biologicheski aktivnykh veschestv na antioksidantuyu aktivnost' fitopreparatov. Khimiko-farmatsevticheskij zhurnal, 2001. no. 6. pp. 40-47.

В последние годы проводится активный поиск растительных источников получения препаратов противовоспалительного действия для использования в комплексной терапии различных заболеваний, которые по сравнению с синтетическими препаратами имеют ряд преимуществ, основным из которых является мягкое воздействие на организм при отсутствии выраженной токсичности. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что одним из механизмов противовоспалительного действия растительных лекарственных препаратов является подавление процессов свободно-радикального окисления в организме. При этом выявлено, что высокое содержание фенольных соединений обусловливает антиоксидантную активность извлечений из лекарственного растительного сырья, которые используются для коррекции антиоксидантного статуса организма [10, 11].

В указанном контексте наше внимание привлекли листья осины обыкновенной (Populus tremula L.), семейство ивовых (Salicaceae), род тополь (Populus), которые используются в народной медицине в качестве противовоспалительных, противоревматических, обезболивающих, противогеморроидальных средств, содержат разнообразный комплекс фенольных соединений [2, 5]. Несмотря на это, до настоящего времени отсутствуют официнальные лекарственные средства из данного вида сырья.

В связи с этим, на кафедре фармацевтической технологии Алтайского государственного медицинского университета была разработана рациональная технология экстракта листьев осины сухого, обеспечивающая высокое содержание в данном экстракционном препарате фенольных соединений (флавоноидов, фенологликозидов, фенолокислот, дубильных веществ) и проведена его стандартизация [4, 6].

Необходимыми этапами разработки нового лекарственного средства, обладающего противовоспалительным действием, является не только определение его специфической, но и выявление возможной антиоксидантной активности, а также изучение его безвредности.

Целью нашего исследования явилось определение острой токсичности экстракта листьев осины сухого и установление его предполагаемого влияния на процессы свободно-радикального окисления.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлся экстракт листьев осины сухой, полученный методом реперколяции в батарее из пяти диффузоров, с использованием в качестве экстрагента спирта этилового 40%, с последующей вакуумной сушкой при температуре не выше 40-50°С. Стандартизация препарата проводилась с использованием хроматографических (тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография), спектроскопических и спектрофотометрических методов. При этом выявлено высокое содержание разнообразных фенольных соединений, в том числе флавоноидов (гиперозид, рутин) - 6,89 ± 0,036% в пересчете на гиперозид, фенологликозидов (салицин, тремулацин) - 18,31 ± 0,854% в пересчете на салицин, фенолокислот (хлорогеновая, п-кумаровая, кофейная, феруловая кислоты) в пересчете на феруловую кислоту - 6,52 ± 0,324%, конденсированных дубильных веществ - 9,60 ± 0,251% [7].

Сырьем для получения сухого экстракта служили листья осины обыкновенной, заготовленные после окончания плодоношения в окрестностях г. Барнаула (конец июня 2009 г). Сырье сушили до воздушно-сухого состояния, упаковывали в двойные бумажные мешки и хранили в сухом прохладном месте.

Определение острой токсичности экстракта листьев осины сухого проводили согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [9] на сертифицированных половозрелых животных обоего пола - 40 белых крысах линии Wistar (массой 160-230 г) и 40 белых мышах (массой 20-25 г), полученных из вивария Института цитологии и генетики СО АН РФ и прошедших карантин в течение 14 суток. Содержание экспериментальных животных осуществлялось в стандартных условиях вивария на обычном рационе при свободном доступе к воде и пище, в условиях нормального температурного и светового режимов. Животные были разделены на 4 группы по 10 крыс (мышей) в каждой.

Первая группа животных получала перорально через желудочный зонд однократно или повторно через короткие интервалы времени (3-4 часа) в течение суток (в технически максимально возможных дозах) водный раствор экстракта листьев осины сухого в дозе 2500 мг/кг; вторая - в дозе 5000 мг/кг; третья - в дозе 7500 мг/кг; четвертая - в дозе 10000 мг/кг. Общая продолжительность наблюдения за животными после введения исследуемого препарата составила 14 дней. В первый день крысы (мыши) находились под непрерывным наблюдением.

Оценку общего состояния животных при введении экстракта проводили с учетом изменения поведенческих реакций, нервно-мышечной возбудимости, некоторых вегетативных функций, а также измеряли массу тела до введения изучаемого препарата и после окончания периода наблюдения [9].

Эксперименты проводили при строгом соблюдении требований Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей» (Страсбург, 1986 г.) и Федерального закона Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г.

Процесс свободно-радикального окисления оценивали in vitro. В качестве основного показателя, определяющего состояние антиоксидантной системы, использовалась общая антиоксидантная активность (ОАА). Антиоксидантную активность экстракта листьев осины сухого в виде 2%-ного водного раствора изучали с использованием модельной системы, которая базируется на способности различных объектов подавлять Fe2+/аскорбат-индуцированное окисление ТВИН-80 in vitro с последующим фотоколориметрическим определением продуктов окисления (малонового диальдегида) после предварительного добавления щелочного раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Оптическую плотность (А) измеряли на фотоэлектроколориметре при длине волны l = 535 нм [8].

Расчет антиоксидантного действия проводили по формуле

ОАА% = ((Ак - Ао)×100)/Ак,

где Ак - оптическая плотность в контроле; Ао- оптическая плотность в опыте.

В качестве параметра оксидантной системы оценивали общую проксидантную активность (ОПА). Суть биохимического метода определения прооксидантной активности в условиях in vitro заключается в способности исследуемых препаратов, в данном случае 2% водного раствора экстракта листьев осины сухого, окислять ТВИН-80, с последующим фотоколориметрическим определением концентрации продуктов окисления (малонового альдегида), ассоциированными тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Оптическую плотность (А) измеряли на фотоэлектроколориметре при длине волны l = 535 нм [8].

Расчет прооксидантного действия проводили по формуле

ОПА% = ((Ао - Ак)×100)/Ао,

где Ак - оптическая плотность в контроле; Ао - оптическая плотность в опыте.

Полученные в результате эксперимента данные обрабатывали статистически методом вариационных рядов с использованием t-критериев Стьюдента [1]. Результаты представлены в виде среднего значения X и ошибки среднего m. Достоверными считали различия при достигнутом уровне значимости p < 0,01.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении острой токсичности энтеральное введение крысам и мышам экстракта листьев осины сухого в дозах от 2500 до 10000 мг/кг массы тела животного не влияло на их общее состояние и не привело к гибели животных. Симптомы острого отравления отсутствовали. В первые сутки у трех крыс-самок наблюдалось незначительное увеличение дефекации при введении экстракта в дозе 10000 мг/кг крысы. В последующем все животные были активны, подвижны, с нормальной координацией движений, стандартной реакцией на внешние раздражители, обычной частотой и глубиной дыхательных движений, нормальной консистенцией фекальных масс, частотой мочеиспускания и окраской мочи, с хорошим аппетитом и нормальным внешним видом. За период наблюдения мыши (самцы и самки) и крысы (самцы и самки) прибавили в массе (табл. 1).

Таблица 1 Сравнительная оценка массы тела крыс и мышей до и через 14 суток после введения экстракта листьев осины сухого (X ± m)

Испытуемые дозы, мг/кг массы тела

Масса животных до введение препарата, г

Масса животных на 14-е сутки наблюдения, г

Прирост массы тела, г

самцы

n = 5

самки

n = 5

самцы

n = 5

самки

n = 5

самцы

n = 5

самки

n = 5

Крысы

2500

184,0 ± 2,5

204,0 ± 5,1

250,0 ± 4,5*

240,0 ± 7,3*

66,0 ± 6,0

36,0 ± 7,0

5000

168,0 ± 3,7

228,0 ± 3,7

220,0 ± 7,1*

252,0 ± 6,6*

52,0 ± 5,8

30,0 ± 5,5

7500

184,0 ± 6,0

214,0 ± 6,0

233,0 ± 3,7*

236,0 ± 2,5*

49,0 ± 3,3

22,0 ± 5,8

10000

214,0 ± 2,5

220,0 ± 3,2

260,0 ± 4,5*

247,0 ± 2,0*

46,0 ± 4,0

27,0 ± 3,7

Мыши

2500

22,77 ± 0,21

21,03 ± 0,29

25,13 ± 0,09*

22,83 ± 0,16*

2,36 ± 0,20

1,80 ± 0,26

5000

23,51 ± 0,35

22,01 ± 0,41

26,97 ± 0,35*

25,24 ± 0,53*

3,38 ± 0,43

3,23 ± 0,46

7500

23,15 ± 0,33

21,43 ± 0,40

27,63 ± 0,41*

25,20 ± 0,35*

4,48 ± 0,35

3,76 ± 0,20

10000

24,06 ± 0,13

21,81 ± 0,23

28,73 ± 0,26*

25,25 ± 0,66*

4,67 ± 0,25

3,44 ± 0,48

Примечание: * - статистически значимые изменения между массой животных на 14-е сутки наблюдения и массой животных до введения препарата (p < 0,01).

В течение 14 суток эксперимента гибели животных не отмечено, в связи с чем, установить LD50 не представилось возможным. Это позволяет считать исследуемый экстракт нетоксичным в испытанном диапазоне и варьировать его дозами в широких пределах (табл. 2).

Поскольку доза 10000 мг/кг не привела к смерти ни одного животного, можно сделать вывод, что LD50 > 10000 мг/кг и согласно ГОСТ 12.1.007-76 можно отнести исследуемый экспериментальный препарат к IV классу опасности (малоопасные ве- щества) [3].

Результаты анализов по определению антиоксидантной и прооксидантной активности экстракта листьев осины сухого представлены в табл. 3.

Таблица 2 Определение острой токсичности экстракта листьев осины сухого

Доза, мг/кг

2500

5000

7500

10000

Выжило

10

10

10

10

Погибло

0

0

0

0

Z

0

0

0

0

D

2500

2500

2500

2500

D·Z

0

0

0

0

Примечание: Z - показатель разницы между количеством погибших животных при использовании двух соседних доз; D - показатель разницы между количеством двух соседних доз.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в опытах in vitro для экстракта листьев осины сухого выявлена высокая активность в отношении процессов свободно-радикального окисления, что, по-видимому, связано с высоким содержанием разнообразных групп фенольных соединений, таких как флавоноиды, фенологликозиды, фенолокислоты, дубильные вещества, и их способностью влиять на изучаемый процесс. При этом исследуемый экстракт проявил как прооксидантную, так и антиоксидантную активность, причем последняя была выражена в значительно большей степени.

В связи с тем, что экстракт листьев осины сухой имеет высокие показатели общей антиоксидантной активности (67,0 ± 1,12%), не исключено, что он обладает способностью улавливать свободные радикалы и за счет этого подавлять процессы пероксидации, выступая в роли прямого антиоксиданта. Показатели общей прооксидантной активностьи изучаемого экстракта (25,1 ± 1,68%) свидетельствуют о том, что он в незначительной степени стимулирует прооксидантную активность и вряд ли обладает способностью прямо индуцировать перекисное окисление липидов клеточных мембран, которое имитирует ТВИН-80.

Таблица 3 Показатели свободно-радикального окисления для экстракта листьев осины сухого in vitro

Номер эксперимента

Антиоксидантная активность

Прооксидантная активность

Оптическая плотность

ОАА,%

Оптическая плотность

ОПА,%

1

0,079

74

0,103

38

2

0,091

70

0,099

35

3

0,099

67

0,079

19

4

0,115

62

0,089

28

5

0,123

59

0,095

33

6

0,109

64

0,09

29

7

0,077

75

0,089

28

8

0,105

65

0,094

32

9

0,095

69

0,077

17

10

0,106

65

0,073

12

11

0,136

55

0,085

25

12

0,105

65

0,089

28

13

0,096

68

0,102

37

14

0,092

70

0,078

18

15

0,08

74

0,077

17

16

0,084

72

0,076

16

17

0,107

65

0,08

20

18

0,103

66

0,081

21

19

0,105

65

0,085

25

20

0,094

69

0,084

24

 

Ек = 0,303

 

Ек = 0,064

 

 

 

67,0 ± 1,12

 

25,1 ± 1,68

Примечание: ОАА - общая антиоксидантая активность, ОПА - общая прооксидантная активность.

Заключение

При анализе результатов изучения острой токсичности при энтеральном введении животным (крысы, мыши) экстракта листьев осины сухого в дозах от 2500 до 10000 мг/кг признаков острой токсичности не выявлено, летальность отсутствовала, что не позволило установить LD50. В связи с чем, изучаемый препарат может быть отнесен, согласно ГОСТ 12.1.007-76 к IV классу опасности (малоопасные вещества).

Суммируя данные экспериментов по изучению антиоксидантной и прооксидантной активности экстракта листьев осины сухого, можно заключить, что биологически активные вещества изучаемого экстракта способны подавлять процессы свободно-радикального окисления, моделируемые in vitro, о чем свидетельствуют высокие показатели общей антиоксидантной активности. Низкие показатели прооксидантной активности указывают на то, что данный экстракт не обладает способностью прямо индуцировать перекисное окисление липидов клеточных мембран.

Полученные данные подтверждают перспективность проведения дальнейших исследований по изучению противовоспалительной активности экстракта и получения на его основе безопасного эффективного противовоспалительного средства.

Рецензенты:

  • Лампатов В.В., д-р биол. наук, профессор кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Барнаул;
  • Зуева Е.П., д-р биол. наук, профессор, зав. лабораторией онкофармакологии ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г. Томск.

Работа поступила в редакцию 20.07.2012.