Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В настоящее время в отечественной и зарубежной литературе активно обсуждается роль апоптоза клеток в норме и патологии. Пристальное внимание уделяется изучению влияния активных форм кислорода на апоптоз и некроз. Оксидативный стресс, определяемый как нарушение баланса между оксидантами и антиоксидантами в пользу первых, является одним из основных патофизиологических индукторов гибели клетки. В связи с этим поиск соединений, стимулирующих или подавляющих апоптоз, составляет одно из актуальных направлений современной биофармакологии.

Объект настоящего исследования - РНКаза Bacillus intermedius (биназа), которая обладает рядом биологических эффектов, в том числе способностью избирательно подавлять рост некоторых линий онкотрансформированных клеток, переводя их на путь апоптоза [2].

В работе исследовано влияние биназы на спонтанный и индуцированный апоптоз субпопуляций лейкоцитов периферической крови человека. Индукцию апоптоза осуществляли в модели оксидативного стресса, вызванного пероксидом водорода.

Биназа (РНКаза Bacillus intermedius) - катионный белок с молекулярной массой 12,3 кДа, изоэлектрической точкой pI 8,9 и максимальной каталитической активностью при рН 8,5. В работе использовали гомогенный препарат РНКазы, полученный по методу [1].

Апоптоз субпопуляций лейкоцитов периферической крови человека исследовали методом лазерной проточной цитометрии с помощью флуорохромов Мероцианина 540 (МС-540) (Sigma) и (TO-PRO-3) дийодид (Invitrogen). Индуктор апоптоза - пероксид водорода (Sigma). Для морфологической оценки апоптоза методом световой микроскопии использовали красители: трипановый синий и Романовского-Гимза (Sigma).

Гепаринизированную венозную кровь условно здоровых доноров отстаивали в течение 30 минут при 37°С, отбирали слой сыворотки с лейкоцитами и отмывали клетки центрифугированием (200 g, 10 мин). Полученный осадок лейкоцитов ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) до конечной концентрации 10⁶ клеток/мл и раскапывали по 250 мкл в пробирки для проточной цитометрии (Falcon 352054, BD). В опытные пробы вносили раствор биназы в фосфатно-солевом буфере (конечная концентрация 400 и 40 мкг/мл) и пероксид водорода (конечная концентрация 3 мМ). В контрольные пробы вносили фосфатно-солевой буфер в эквивалентном объеме. Клетки инкубировали 3 часа в СО₂-инкубаторе при 37°С и 100% влажности. После инкубации клетки дважды промывали в фосфатно-солевом буфере центрифугированием при 250 g в течение 5 минут, ресуспензировали в 500 мкл буфера и вносили флуорохромы МС540 и TO-PRO-3 йодид. Пробы инкубировали 10 минут в атомосфере 5% СО₂ при 37°С и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Определение экспрессии фосфатидилсерина и проницаемости цитоплазматической мембраны методом проточной цитометрии

Цитометрический анализ субпопуляций лейкоцитов проводили на проточном лазерном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA), оснащенном двумя лазерами с длиной волны 488 и 635 нм. Экспрессию фосфатидилсерина (ФС) и проницаемость плазматической мембраны на уровне отдельной клетки оценивали по модифицированному протоколу [10]. В суспензию, содержащую 10⁶ клеток/мл, за 10 мин. перед цитометрическим анализом вносили ФС-связывающий флуорохром МС-540 в конечной концентрации 0,2 мкг/мл. Для оценки проницаемости плазматической мембраны в клеточную суспензию одновременно с MC-540 вносили TO-PRO-3-йодид в конечной концентрации 0,2 мкМ. МС540 связывается с остатками фосфатидилсерина, экспонированного на мембране апоптозных клеток. ДНК-тропный флуорохром TO-PRO-3 через поврежденную цитоплазматическую мембрану проникает внутрь клетки и окрашивает ДНК. Лимфоидную, моноцитарную и гранулоцитарную субпопуляции выделяли по показателям прямого (FSC, диаметр клетки) и бокового (SSC, гранулярность клетки) светорассеяния. После исключения дебриса и выделения лимфоидного, моноцитарного и гранулоцитарного гейтов, определяли долю:

1. интактных клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3(-)];
2. клеток на ранней стадии апоптоза [фенотип MC540(+)TO-PRO-3(-)];
3. клеток на поздней стадии апоптоза [фенотип MC540(+)TO-PRO-3(+)];
4. некротических клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3(+)].

На каждый вариант опыта просчитывали не менее 25000 клеточных событий. Результаты измерений обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD Biosciences), статистический анализ полученных результатов выполняли по критерию хи-квадрат с коррекцией Yates в пакете прикладных программ STATISTICA 6.0.

Выделение перитонеальных макрофагов крысы

В экспериментах использовали перитонеальные макрофаги белых беспородных крыс 5-6 недельного возраста. Работу с крысами проводили с соблюдением принципов Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Крыс забивали декапитацией под эфирным наркозом. Перитонеальные макрофаги выделяли из перитонеальных смывов, вводя животным в брюшную полость холодный 0.9% раствор NaCl. Клетки промывали физиологическим раствором, суспендировали в среде PRMI (Sigma, США), разводили до концентрации 1,2∙10⁶ кл/мл и использовали в эксперименте.

Изучение влияния биназы на жизнеспособность, некроз и апоптоз макрофагов

Макрофаги, разведенные в среде RPMI 1640 до концентрации 1,2∙10⁶ кл/мл, наносили на покровные стекла в объеме 0,1 мл и оставляли на 20 мин при 37°C для адгезии клеток. Затем клетки на стёклах дважды промывали средой и к опытным образцам добавляли раствор биназы в среде RPMI в конечной концентрации 100 и 200 мкг/мл. Стекла помещали на 0,5 часа в СО₂-инкубатор (37°C), после чего заменяли среду с ферментом на среду, содержащую 2 мМ Н₂О₂, и инкубировали 3 час. В качестве контролей использовали интактные клетки, инкубированные в питательной среде, а также клетки, в которые добавляли раствор Н₂О₂ без предварительной инкубации с ферментом.

Идентификацию жизнеспособных, некротических и апоптотических клеток осуществляли методом световой микроскопии. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью витального красителя трипанового синего. Некротическую и апоптотическую гибель клеток дифференцировали по характерным морфологическим признакам [5] после окрашивания клеток по методике Романовского-Гимза [4]. Апоптотическими считали клетки только с фрагментированными ядрами (т.е. в позднем апоптозе). Анализировали несколько полей зрения на каждом стекле (не менее 600 клеток) и рассчитывали относительное содержание каждой клеточной популяции. Различия долей полагали достоверными при значениях Р ≤ 0,05.

Влияние биназы на апоптоз исследовали в гранулоцитарной, моноцитарной и лимфоидной популяциях лейкоцитов. Согласно результатам, полученным нами ранее [3], биназа в концентрации до 100 мкг/мл стимулировала функциональную активность макрофагов, а в концентрации выше 100 мкг/мл ингибировала её. Тенденция сохраняется и в отношении других клеток, в том числе онкотрансформированных, для которых цитотоксичными являются высокие концентрации РНКаз [2]. В связи с этим в работе мы исследовали две концентрации биназы: 40 мкг/мл (нетоксичная) и 400 мкг/мл (токсичная).

При действии биназы в концентрации 40 мкг/мл распределение моноцитов по стадиям апоптоза не отличается от контрольного (рис. 1Б, В). При концентрации биназы 400 мкг/мл доля моноцитов в поздней стадии апоптоза увеличивается на 92,2% (рис. 1В). Биназа в концентрациях 40 и 400 мкг/мл не модифицирует апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов (рис. 2Б, В и 3Б, В). Пероксид водорода в концентрации 3 мМ эффективно стимулирует программированную клеточную гибель моноцитов (рис. 1б, в), лимфоцитов (рис. 2 Б, В) и гранулоцитов (рис. 3 Б, В). Биназа в концентрации 40 мкг/мл на 72,3% увеличивает долю MC540(-)TO-PRO-3(-) жизнеспособных моноцитов, обработанных пероксидом водорода (рис. 1А). Протекторный эффект биназы в отношении моноцитов исчезает при концентрации 400 мкг/мл. Биназа в концентрации 400 мкг/мл модифицирует динамику Н₂О₂-индуцированного апоптоза моноцитов, увеличивая накопление клеток в стадии раннего апоптоза на 24,9% (рис. 1Б). Биназа в концентрациях 40 и 400 мкг/мл не увеличивает долю MC540(-)TO-PRO3(-) жизнеспособных лимфоцитов и гранулоцитов, обработанных пероксидом водорода (рис. 2А и 3А), и достоверно не модифицирует Н₂О₂-индуцированный апоптоз гранулоцитов и лимфоцитов (рис. 2Б, В и 3Б, В).

Таким образом, биназа в концентрации 400 мкг/мл избирательно стимулирует апоптоз моноцитов. В условиях оксидативного стресса, вызванного H₂O₂, биназа оказывает дифференцированное влияние на апоптоз моноцитов в зависимости от концентрации (рис. 4).

Поскольку моноциты являются предшественниками макрофагов и гистогенетически представляют собой один тип клеток (мононуклеарные фагоциты), мы сопоставили эффекты биназы в моноцитах донорской крови с таковыми для перитонеальных макрофагов крысы (рис. 5). Биназа в концентрации 200 и 400 мкг/мл стимулирует апоптоз макрофагов. Через 18 часов инкубации монослойной культуры макрофагов с биназой доля апоптотических клеток составляла более 50% по сравнению с 5-7% в контроле (данные не показаны). В условиях оксидативного стресса предварительная инкубация макрофагов с биназой приводила к снижению гибели перитонеальных макрофагов от некроза, переводя клетки на доминирующий путь апоптоза. При концентрации 200 мкг/мл наблюдалась тенденция к увеличению доли жизнеспособных клеток (рис. 5).

Согласно результатам, у моноцитов крови человека в модели оксидативного стресса после инкубации с биназой в низкой концентрации также увеличивалась жизнеспособность, а при высокой концентрации биназы наблюдалась ко-стимуляция апоптогенного эффекта Н₂О₂ и торможение процесса перехода клеток из ранней стадии апоптоза в позднюю. Таким образом, в мононуклеарных фагоцитах крысы и человека биназа проявляет сходный апоптоз-модулирующий эффект.

На основании полученных результатов, а также данных публикаций, мы высказываем следующее предположение о возможных путях реализации обнаруженных эффектов биназы на клеточном уровне. Принимая во внимание, что бактерии рода Bacillus взаимодействуют с макрофагами через TLR-2 и TLR-4 рецепторы [7], а биназа концентрационно зависимо модулирует функциональную активность макрофагов [3], мы полагаем, что дифференцированный эффект биназы в популяциях лейкоцитов может быть опосредован Toll-подобными рецепторами (TLR). Как свидетельствуют многочисленные исследования последних лет, TLR участвуют в передаче про- и антиапоптогенных сигналов в клетке [8, 9]. Вместе с тем имеются работы, в которых показано, что пероксид водорода также инициирует TLR-зависимую апоптогенную сигнализацию [6]. В связи с этим можно предположить, что адсорбция биназы на клеточной поверхности прямо или косвенно будет оказывать влияние на TLR-опосредованные апоптогенные сигнальные пути и, в зависимости от условий, модулировать апоптоз в мононуклеарных фагоцитах. Изучение потенциальных TLR-зависимых механизмов избирательного действия биназы в мононуклеарных фагоцитах заслуживает дальнейшего исследования.

Выводы

1. Биназа избирательно активирует апоптоз моноцитов крови человека и не влияет на программированную клеточную гибель лимфоцитов и гранулоцитов.
2. В условиях оксидативного стресса предварительная инкубация лейкоцитов с биназой увеличивает субпопуляцию жизнеспособных моноцитов и меняет динамику Н₂О₂-индуцированного апоптоза, повышая долю моноцитов в стадии раннего апоптоза.
3. Биназа не модифицирует Н₂О₂-инду­ци­рованный апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов.

Рецензенты:

• Багаева Т.В., д.б.н., профессор, зав.кафедрой биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета Минобрнауки РФ, г. Казань;
• Жданов Р.И., д.х.н., профессор кафедры фармакологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета Минобрнауки РФ, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 25.06.2012.