Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

SOME BIOLOGICAL PROPERTIES OF ENTEROCOCCI AND BLASTOCYSTIS HOMINIS IN THE ALGORITHM OF ASSOCIATIVE SYMBIOTIC INTERACTION BEFORE AND AFTER THE COCULTURE

Bugero N.V. 1 Potaturkina-Nesterova N.J. 1
1 Ulyanovsk State University, Ulyanovsk
Interrelation of microbes – associates play a key role in defining causal-result relations between the world of microbes and pathological condition of a man. An analysis of displays of numerous microbal associations allows us to explain pathogenesis of a number of infection diseases of different etiology, correctly estimate an origin of various anomalies in structure of micro-organisms that lead to alteration in their typical, or display new unusual biological characteristics. The work contains an analysis of biological traits of bacetrias of Enterococcus type and the simplest Blastocystis hominis in terms of associative symbiotic interaction before and after co-cultivation. The authors have studied saccharolytic, proteolytic, hemolytic, colicinogenic activity and anti-bacterial resistance of Enterococcus bacterias and hemolytic, DNA, proteolytic, leciovetilazious, and lipolytic activity of the simplest Blastocystis hominis. Experimental data has shown a synergism in strengthening of hemolytic, colicinogenic, proteolytic activity and anti-bacterial resistance among enterococcus bacterias and increase in hemolytic, DNA, proteolytic, eciovetilazious, and lipolytic activity among Blastocystis hominis. Antagonism has been displayed only concerning saccharolytic ability of bacterias.
Blastocystis hominis
enterococcus
associative symbiosis
pathogenesis
infective diseases
1. Romanenko N.A., Sergiev V.P. Ohrana okruzhajuwej sredy kak vazhnejshij komponent profilaktiki massovyh parazitov v jekstremal'nyh prirodno-klimaticheskih uslovijah severa Rossii. Med. parazitol., 2008, no.3, pp. 16–19.
2. Toropova N.T., Safronova N.A., Gordeeva L.M. Parazitarnaja fauna kishechnika u detej, stradajuwih atopicheskim dermatitom. Aspekty diagnostiki patogeneza. Rossijskij zhurnal kozhnyh i venericheskih boleznej, 1998, no.2, pp. 27–32.
3. Navashin S.M., Chuchalin A.G., Belousova Ju.B. Antibakterial'naja terapija pnevmonii u vzroslyh: Ucheb.posobie, Moscow, 1998, p. 28.
4. Potaturkina-Nesterova N.I., Krasnoperova Ju.Ju., Cheban N.M., Il'ina N.A. Izuchenie jetiopatogeneticheskoj roli Blastocystis hominis v patologii zheludochno-kishechnogo trakta. Materialy 2-oj obedinennoj Vserossijskoj i Vsearmejskoj nauchnoj konferencii «S.-Peterburg. Gastro-2000», S.-Peterburg, 2000, no. 1–2, p. 194.
5. Birger M.O. Spravochnik po mikrobiologicheskim i virusologicheskim metodam issledovanija. Moscow, Medicina, 1982, 464 p.
6. Tec V.V. ZhMJeI, 1997, no. 1, pp. 106–111.
7. Guignard S, Arienti H, Freyre L, Lujan H, Rubinstein H., Frasi M. Prevalence of enteroparasites in a residence for children in the Córdoba province, Argentina. European Journal of Epidemiology, 2000, – no. 16, pp. 287–293.
8. Taamasri P, Mungthin M, Rangsin R, Tongupprakarn B, Areekul W, Leelayoova S. Transmission of intestinal blastocystosis related to the quality of drinking water. Southeast Asian Journal Tropical Medicine and Public Health, 2000, no. 31, pp. 112–117.
9. Abe N, Wu Z, Yoshikawa H. Molecular characterization of Blastocystis isolates from primates. Veterinary Parasitology, 2003, no. 113, pp. 321–325.

В последние годы в России официально регистрируется более 1,2 миллионов больных различными паразитоценозами, среди которых отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами [1].

Известно, что у лиц, страдающих заболеваниями пищеварительного тракта, очень высок показатель паразитарных инвазий, в частности бластоцистоза [2]. Данная протозойная инфекция этиологически ассоциирована с простейшими Blastocystis hominis, паразитирующими преимущественно в толстом отделе кишечника человека [8, 9].

Возбудитель бластоцистной инвазии является микроорганизмом, к усилению агрессии которого, с одной стороны, могут приводить факторы, снижающие защитные силы макроорганизма, а с другой стороны - микроорганизмы, входящие в состав биоценоза. Естественно, что при освоении биотопов тела человека между микробами складываются определенные взаимоотношения, которые отражаются на качественной и количественной характеристике того или иного микробного пейзажа [4].

Анализ направленности межмикробных взаимоотношений ассоциативных микросимбионтов позволяет прояснить патогенез широкого спектра заболеваний, правильно оценить происхождение тех или иных аномалий в структуре микросимбионтов, приводящих к изменению их типичных или проявлению новых биологических свойств [9].

Нарушая баланс микроорганизмов, данные возбудители способствуют созданию благоприятных условий для развития патологических процессов [8]. Результаты собственных исследований показали, что бластоцистная инвазия сопровождается качественными и количественными изменениями микрофлоры кишечника человека. Выявлено, что на фоне бластоцистоза увеличивается обсемененность толстой кишки условно-патогенными бактериями рода Enterococcus - Е.faecflis, которые относят к нормальным симбионтам. Интенсивные исследования последних лет позволили установить, что данные бактерии синтезируют существенное количество веществ, так называемых факторов вирулентности, способствующие развитию инфекционного процесса. К таким факторам можно отнести поверхностные белки, участвующие в процессе адгезии и инвазии, экскретируемые белки и токсины, обеспечивающие повреждение тканей хозяина, а также факторы, индуцирующие воспаление [7].

Ранее нами были изучены персистентные свойства энтерококков в монокультуре и при сокультивировании с Blastocystis hominis. Выявлено нарастание экспрессии персистентных характеристик у бактерий энтерококков при бластоцистозе, которое ограничивает размножение паразитов в кишечнике больных, что представляет собой процесс взаимной адаптации, направленный на обеспечении совместного длительного паразитирования в макроорганизме.

Тем не менее, не изученными остаются другие не мало важные биологические свойства бактерий рода Enterococcus и простейших Blastocystis hominis в ходе межмикробных взаимодействий, в частности в протозойно-бактериальных ассоциациях.

В связи с этим целью нашего исследования явилось изучение биологических свойств, таких как: сахаролитическая, протеолитическая, гемолитическая, колициногенная активности и антибиотикорезистентность бактерий Enterococcus и гемолитическая, ДНК-азная, протеолитическая, лецитоветилазная и липолитическая простейших Blastocystis hominis до и после совместного культивирования.

Материалы и методы исследования

Исследования микробного пейзажа кишечника проводили в период с 2006 по 2010 года на базе бактериологических лабораторий ГУЗ «Покровская больница», городской клинической больницы №40 г. Санкт-Петербурга. Определение гемолитической, протеолитической, ДНК-азной и колициногенной активностей определяли по методике Биргера [5], липолитическую активность с использованием метода Slifkin [9], лецитоветилазную по методике Теца [6], антибиотикочувствительность исследуемых культур определяли с использованием методике Навашина, Чучалина, Белоусова [3]. Микробный пейзаж кишечника изучали согласно Приказу № 535 от 22.04.85 МЗ РСФСР «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях и лечебно-профилактических учреждениях». Выявление бластоцист в препаратах проводили путем микроскопии нативных или окрашенных мазков. Для получения культур простейших B.hominis использовали среду Suresh. Культивирование с целью изучения взаимного влияния микробов-ассоциантов проводили in vitro на модифицированной среде Surech (приоритетная справка № 2008115689).

В работе использованы 188 штаммов микроорганизмов, выделенных от больных с патологией желудочно-кишечного тракта: 78 штаммов простейших Blastocystis hominis, 66 штаммов Enterococcus faecalis. Было обследовано 120 человек в возрасте от 20 до 70 лет (80% - женщины).

Результаты исследования и их обсуждения

Результаты исследований свидетельствуют о достаточно высокой встречаемости бактерий рода энетерококков у лиц инвазированных бластоцистами.

При изменении вирулентности бластоцист от LD50/lg 0 до 5,3 ± 0,2 статистически достоверно резко изменялась обсемененность кишечника микробами Enterococcus faecflis. Значение их обсемененности изменялись от lg 3,1 ± 0,3 до lg 8,1 ± 0,3 КОЕ/г (р ≤ 0,001).

Проведенные исследования показали, что в ходе контакта Е.faecflis с бластоцистами отмечены изменения их патогенных свойств: усиление (синергизм), ослабление (антагонизм), и индифферентное влияние.

Синергизм при сокультивировании Е.faecflis и бластоцист проявляется в увеличении коэффициента гемолитической и колициногенной активностей бактерий до 6,6 ± 0,5 и 5,1 ± 0,21 ед соответственно (до сокультивирования - 1,5 ± 0,03 и 3,92 ± 0,13, в монокультурах - 1,7 ± 0,3 и 2,9 ± 0,13 ед соответственно, р ≤ 0,001).

В результате совместной инкубации простейших и бактерий изменилась так же чувствительность последних к антибактериальным препаратам у всех 66 штаммов (100%) (табл. 1). Усиление антибиотикорезистентности штаммов выделенных после совместного культивирования по отношению к культурам, выделенным из кишечника, произошло в 1,69 раза.

Изучение протеолитической активности энтерококков также выявило синергидное взаимодействие. До совместного культивирования данным видом активности обладали 32 культуры (52,31%), после - все 66 (100%), в монокультурах - 26 (20,77%). У всех изолированных Е.faecflis была изучена сахаролитическая активность, по отношению к следующим углеводам: лактоза, глюкоза, мальтоза, сахароза, фруктоза (табл. 1).

Как показано в табл. 1 после взаимодействия бактерий с бластоцистами in vitro сахаралитическая активность значительно снизилась.

Таблица 1

Сравнительная характеристика чувствительности к антибиотикам штаммов Е.faecflis

№ п/п

Антибиотики

Е.faecflis, выделенные после сокульт-ия

(n = 130)

Е.faecflis, выделенные до сокульт-ия (n = 130)

Е.faecflis, изолированная из монокультур (n = 130)

МПК (мкг/мл)

МПК (мкг/мл)

МПК (мкг/мл)

1.

Азитромицин

60,6 ± 0,7**

39,3 ± 0,4*

32,2 ± 0,2*

2.

Ципрофлоксацин

47,3 ± 0,5**

25,9 ± 0,4*

20,6 ± 0,1*

3.

Цефазолин

10,4 ± 0,3*

7,9 ± 0,7*

6,3 ± 0,2*

4.

Гентамицин

39,2 ± 0,8**

18,3 ± 0,6*

14,7 ± 0,5*

Примечание: * - Р < 0,05; ** - Р ≤ 0,001.

Полученные данные свидетельствуют об антагонистическом воздействии простейших B.hominis на способность энтерококков гидролизовать углеводы (табл. 2).

Определение факторов патогенности Blastocystis hominis, показало синергидное взаимодействие бактерий и простейших, которое привело к усилению ДНК-азной, гемолитической, липазной, лецитоветилазной и протеолитической активностей.

Из 78 изолятов паразитов после совместной инкубации со штаммами Е.faecflis 58 культур (84,1%) приобрели способность разрушать эритроциты крови человека. Тогда как до инкубации данным свойством обладали только 26 штаммов (38,41%).

В монокультуре (табл. 2) способность разрушать эритроциты крови человека сохранили только 5 штаммов (4,6%). Коэффициент гемолитической активности штаммов простейших выделенных из кишечного микробиоценоза составил 1,48 ± 0,02 ед, культур из ассоциации с Е. faecflis после совместной инкубации повысился до 3,2 ± 0,02 (в монокульту- рах - 0,7 ± 0,1 ед, р ≤ 0,001).

Таблица 2

Сравнительная характеристика сахаролитической активности Enterococcus faecalis
до и после совместного культивирования с B.hominis

Ферментируемые углеводы

Активность ферментации

Количество штаммов Е.faecflis

монокультуры
n = 130

до сокульт-ия n = 130

после n = 130

Лактоза

Нормальная

130

85

-

Замедленная

-

45

130

Отсутствие

-

_

-

Мальтоза

Нормальная

130

85

-

Замедленная

-

45

31

Отсутствие

-

-

99

Глюкоза

Нормальная

130

-

_

Замедленная

-

85

_

Отсутствие

_

45

130

Сахароза

Нормальная

130

-

-

Замедленная

-

130

-

Отсутствие

-

-

130

Фруктоза

Нормальная

130

-

_

Замедленная

-

130

-

Отсутствие

-

-

130

Среди штаммов бластоцист, выделенных из консорциума после взаимодействия in vitro, ДНК-азной активностью обладали 62 культуры (97,3%), коэффициент ДНК-азной активности составил 4,7 ± 0,3 ед. В группе изолятов, изолированных из толстой кишки способность к разрушению ДНК выявили у 27 культур (90,1%), коэффициент активности равнялся 1,6 ± 0,2 ед., р ≤ 0,001. Из монокультур бластоцист только 9 (9,9%) характеризовались ДНК-азной активностью, коэффициент - 0,9 ± 0,4 ед. Изучение липолитической активности культур после сокультивирования показало увеличение значений коэффициентов до 5,7 ± 0,3 ед. (у штаммов, полученных до сокультивирования - 1,38 ± 0,5, из монокультуры - 0,5 ± 0,6 ед., р≤0,001).

Способность продуцировать лецитиназу также увеличивалась у простейших после совместного культивирования с бактериями Е.faecflis. Лецитоветилазная активность проявилась у 58 культур (96,7%), коэффициент активности составил 5,3 ± 0,2 ед. Коэффициент лецитоветилазной активности штаммов бластоцист, изученных до совместного культивирования, равнялся 1,69 ± 0,5 ед., у бластоцист из монокультуры - 0,8 ± 0,4 ед., р ≤ 0,001.

Заключительным этапом исследований, посвященных изучению факторов патогенности, простейших-ассоциантов явилось определение протеолитических ферментов. Как показали исследования 74 культуры бластоцист в результате взаимодействия с Е.faecflis in vitro (49,0%) приобрели способность гидролизовать молочный белок. Из группы бластоцист, выделенных из ассоциаций толстой кишки, данной способностью характеризовались 39 изолятов (25,83%), у бластоцист из монокультуры протеолитической активностью обладали 13 штаммов (8,6%).

Заключение

Таким образом, в ходе межмикробных взаимодействий ассоциативных микросимбионтов синергизм проявлялся в усилении гемолитической, колициногенной, протеолитической активностей и антибиотикорезистентности со стороны бактерий и увеличении гемолитической, ДНК-азной, протеолитической, лецитоветилазной, липолитической активностей со стороны Blastocystis hominis. Антогонизм - только в отношении сахаролитической способности бактерий.

Рецензент:

  • Ильина Н.А., д.б.н, профессор кафедры зоологии, проректор по научной работе ФГБОУ ВПО УЛГПУ им. И.Н. Ульянова, г. Чебоксары;
  • Нестеров А.С., д.м.н., профессор кафедры инфекционных и кожно-венеро­логи­чес­ких болезней ФГБО УВПО УлГУ, г. Волгоград.

Работа поступила в редакцию 25.04.2012