Высокая распространенность, сложный патогенез и течение хронических воспалительных заболеваний кожи (ХВЗК) человека определяют актуальность разработки новых методов лечения [2, 7], эффективность которых необходимо тестировать на животных моделях, адекватно воспроизводящих определенную форму или стадию дерматоза. Стандартные индуцированные мышиные модели ХВЗК (например, химический ожог [1]), воссоздают только острую стадию заболевания человека, тогда как спонтанные модели помогают изучать закономерности хронического течения воспалительного процесса. Для этих целей предлагается коллекция мышиных моделей разных генотипов [11], которые при одинаковом спектре инфекционных агентов (внутрививарные возбудители) воспроизводят симптомы, напоминающие разные стадии и нозологические формы ХВЗК человека. Так, например, мыши линии CBRB в зависимости от возраста и проводимого симптоматического лечения спонтанно воспроизводят разные формы ХВЗК человека, при этом полного выздоровления старых животных практически не наблюдается [3]. В медицинской практике пожилые пациенты также практически не отвечают на традиционно применяемую комплексную терапию противовоспалительными препаратами и антибиотиками [9]. Новым подходом к лечению ХВЗК является пероральное использование пробиотиков на основе молочнокислых бактерий [8]. Возможный механизм действия пробиотических бактерий заключается в подавлении роста патогенов и их конкурентном исключении из полости кишечника за счет синтеза антимикробных веществ и иммуномодуляции [10].
Ранее из коровьего молока в Бурятии был выделен перспективный штамм Lactococcus lactis subsp. lactis 194 [4]; его активный вариант, полученный при диссоциации культуры, был обозначен как L. lactis subsp. lactis 194-К. Штамм 194-К образует антибиотический комплекс с широким спектром действия, который подавляет развитие грамположительных, грамотрицательных бактерий, а также микроскопических грибов [5]. Данное свойство является довольно редким для лактококков, что делает штамм 194-К уникальным. Кроме того, лактококки подвида L. lactis subsp. lactis имеют статус GRAS (generally regarded as safe) и разрешены к использованию в пищевой промышленности. Таким образом, изучение свойств штамма 194-К in vivo на адекватной модели ХВЗК человека является актуальным.
Целью настоящей работы было исследование долгосрочного влияния культуральной жидкости штамма 194-К in vivo на проявление симптомов хронического дерматоза у стареющих самцов мышей линии CBRB.
Материалы и методы исследования
В исследовании были использованы самцы мышей оригинальной линии CBRB-Rb (8.17)1Iem, далее CBRB [3, 11] с симптомами спонтанного ХВЗК в возрасте 23,0 ± 1,3 недели. Мышей разводили инбредно и содержали в конвенциональных условиях при естественном режиме освещения. Каждой мыши при регистрации в племенном журнале присваивали собственную метку, различимую в течение всей жизни, что позволяло проследить изучаемые параметры индивидуально. Животных кормили полнорационными гранулированными кормами для мышей и крыс. В качестве стандартной подкормки использовали зерновые каши с добавлением подсолнечного масла и витаминов А, Е, D, F по разработанной ранее рецептуре (5 г на мышь в день); воду предоставляли без ограничений. Самцам опытной группы (n = 17) ежедневно в течение четырех недель добавляли к подкормке культуральную жидкость штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К (КЖ, 300 мкл на мышь в день) с антибиотической активностью 3600 МЕ/мл. В составе КЖ были живые клетки лактококков и их метаболиты, включая антибиотические вещества и молочную кислоту (pH 4,2). Животным контрольной группы (n = 15) к подкормке добавляли раствор молочной кислоты в тех же количествах (рН 4,2). Культуру L. lactis subsp. lactis 194-К, хранившуюся в обрате (обезжиренном молоке), культивировали при 28°С в течение 20-25 ч в стационарных условиях в посевной среде, приготовленной на водопроводной воде с дрожжевым экстрактом (20 г/л) и глюкозой (10 г/л); рН 6,8-7,0. Затем культуру из посевной среды в количестве 5% вносили в ферментационную среду, содержащую (г/л): сахарозу - 20,0; KH2PO4 - 10,0; NaCl - 2,0; MgSO4 - 0,2; дрожжевой экстракт - 20,0; рН 6,8-7,0 и культивировали в тех же условиях. Биомассу определяли нефелометрически на ФЭК-56 (Россия) при 540 нм. Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с измерением зоны ингибирования роста тест-организма, мм. В качестве тест-организма использовали спорообразующую кислотоустойчивую бактерию Bacillus coagulans 429 [4].
Оценку проявления симптомов ХВЗК проводили независимо два экспериментатора двойным слепым методом раз в неделю у всех животных индивидуально. Регистрировали следующие параметры:
1) вес животного, г;
2) степень изъязвления кожи на спине по 7-балльной шкале (0 - нет повреждений; 1 - только перхоть; 2-4 балла - симптоматика, сходная с импетиго человека; 5-6 баллов -симптоматика, сходная с проникающей эктимой; 7 баллов - симптоматика, сходная с синдромом ошпаренной кожи);
3) степень проявления алопеции на спине и голове отдельно по 7-балльной шкале (0 - волосяной покров не нарушен; 1 - нарушена только структура волоса, нет оголенных участков кожи; 2 - отсутствие шерстного покрова на 10-20% площади повреждения; 3 - на 30-40% площади повреждения; и т.д.);
4) площадь пораженного участка спины, мм2 (только алопеция, только изъязвления или оба симптома). На день начала эксперимента мышей разделили на опыт и контроль таким образом, что в обеих группах значения всех вышеперечисленных параметров были в среднем одинаковы.
Относительное изменение параметров в опытной группе по сравнению с контрольной по мере проведения эксперимента определяли по формуле
(Оi - Ki)/Ki·100%,
где Оi - значение показателя в опытной группе; Кi - значение аналогичного параметра в контроле в то же самое время.
В конце эксперимента выборочно провели микробиологическое исследование смывов с кожного покрова спины мышей. Для этого из опытной (n = 2) и контрольной (n = 2) групп были выбраны мыши со средними по группе значениями массы тела с максимально и минимально выраженными изъязвлениями. Пробы отбирали стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором, протирали поверхность кожи мыши площадью 20×20 мм и помещали его в пробирку с физиологическим раствором. Высев производили на дифференцирующие среды: МПА и Байрд-Паркер. Общую обсемененность определяли по количеству колоний на среде с МПА («ЗАО НИЦФ», Россия) через 24-48 ч при 30°С; наличие стафилококков определяли по лецитиназной реакции на среде Байрд-Паркер («HiMedia», Индия) [6]. Количество КОЕ расчитывали на 1 мл пробы.
Данные вводили и анализировали в программе Excel и представляли как среднее ± стандартная ошибка среднего, статистическую значимость различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Ежедневное употребление мышами культуральной жидкости L. lactis subsp. lactis 194-К (КЖ) per os уже через одну неделю привело к улучшению состояния кожи спины у пролеченных мышей: изъязвления на спине были выражены в среднем на 80% меньше, чем у контрольных мышей (рис. 1, а и б, р = 0,01). Однако после двух недель применения КЖ в опытной группе наблюдалось достоверное (р = 0,007) ухудшение по сравнению с началом эксперимента и значения степени изъязвления кожи в опытной и контрольной группах к этому сроку не различались (рис. 1,а). Вероятно, слишком продолжительное применение препарата в используемой дозировке могло привести к проявлению побочных эффектов пробиотика [10].
Рис. 1. Степень изъязвления на спине у самцов мышей линии CBRB: а - динамика изменения (баллы), ■ - опыт, ● - контроль; б - относительное изменение степени изъязвления кожи животных,%.
*** - уровень достоверности различий показателя в опыте и контроле, р = 0,001
Применение КЖ per os уже через одну неделю привело к улучшению состояния шерстного покрова экспериментальных животных по сравнению с контрольными (рис. 2,а). Наименьшая степень проявления алопеции в опытной группе наблюдалась через две недели применения препарата, когда уменьшение по сравнению с началом эксперимента составило 18% (р = 0,04). Начиная с первой недели, и далее в течение всего эксперимента, степень проявления алопеции в опытной группе была достоверно меньше на 21-25% по сравнению с показателями в контрольной группе (рис. 2,б).
Рис. 2. Степень проявления алопеции на спине у самцов мышей линии CBRB: а - динамика изменения степени алопеции (баллы), ■ - опыт, ● - контроль; б - относительное изменение степени алопеции в опытной группе по сравнению с контрольной,%. * - р = 0,02; ** - р = 0,01; *** - р = 0,001 - уровни достоверности различий показателя в опыте и контроле
Уже через одну неделю эксперимента в опытной группе площадь пораженного участка спины в среднем была меньше, чем в контроле на 24% (р = 0,02, рис. 3,а и б). После двух недель применения препарата не было достоверных различий по площади пораженного участка между опытной и контрольной группами вплоть до конца эксперимента, при этом в пролеченной группе наблюдалась тенденция к ухудшению.
Рис. 3. Изменение площади пораженного участка спины у самцов мышей линии CBRB: а - динамика изменения площади поражения (мм2); ■ - опыт, ● - контроль; б - относительное изменение площади повреждения кожи животных в опытной группе по сравнению с контрольной,%. * - уровень достоверности различий показателя в опыте и контроле, р = 0,02
Через неделю эксперимента наблюдалась тенденция к уменьшению массы тела пролеченных мышей (р = 0,09). Однако к 4-й неделе пролеченные животные весили больше, чем на момент начала приема пробиотика (рис. 4,а и б, р = 0,003), что было достоверно больше веса контрольных животных (рис. 4,а; р = 0,02). Масса тела опытных животных повысилась и практически не менялась до конца эксперимента, в то время как у мышей контрольной группы наблюдались значительные колебания массы тела и к концу эксперимента привесы отсутствовали.
Рис. 4. Изменение веса животных у самцов мышей линии CBRB: а - динамика изменения веса, ■ - опыт, ● - контроль; б - относительный привес в опытной группе по сравнению с контрольной,%. * - уровень достоверности различий показателя в опыте и контроле, р = 0,02
Наиболее частыми возбудителями ХВЗК человека являются бактерии Staphylococcus spp., Streptococcus spp., а иногда и нормальная микрофлора кожи [7]. Обсемененность кожи и слизистых оболочек пациента зависит от возраста, условий жизни, индивидуальных особенностей кожных покровов, сопутствующих заболеваний и множества других факторов. Ранее было показано, что выраженность проявлений симптомов ХВЗК у старых самок мышей линии CBRB (возраст 70 недель), также как и у человека, была связана с наличием на их коже стафилококков [3]. В локализованной форме это заболевание мышей напоминает импетиго, а в генерализованной - синдром ошпаренной кожи человека, тогда как промежуточные стадии заболевания мышей напоминают проникающую эктиму человека. Как и ранее у самок [3], микробиологическое исследование кожных покровов самцов мышей CBRB обнаружило отсутствие обсемененности патогенной микрофлорой клинически здоровых животных. В настоящем исследовании на коже самцов CBRB в возрасте 23 недели в опытной и контрольной группах на конец эксперимента стафилококки не были обнаружены, либо присутствовали в незначительных количествах (до 10 КОЕ/мл, данные не показаны). Однако общая обсемененность коррелировала со степенью выраженности симптомов ХВЗК: в смывах кожи с поверхностными изъязвлениями типа импетиго (1-2 балла) достоверно значимое количество микроорганизмов (более 10 КОЕ/мл) не было выявлено, тогда как на коже животных с более глубокими изъязвлениями типа эктимы (3-4 балла) микроорганизмы присутствовали в заметно больших количествах (до 50 КОЕ/мл). По морфологии выросшие колонии были представлены одиночными грамположительными кокками, которые можно отнести к сапрофитной микробиоте кожи.
Заключение
Таким образом, в ходе данной работы было показано, что добавление культуры L. lactis subsp. lactis 194-К в подкормку самцов мышей линии СВRB уже через неделю приводит к достоверному уменьшению проявления всех регистрируемых нами симптомов ХВЗК мышей. Однако более длительное применение препарата в течение четырех недель, вероятно, могло послужить причиной тенденции к усилению ряда симптомов ХВЗК мышей. Поэтому, очевидно, схема применения препарата в качестве биодобавки в дальнейшем должна быть оптимизирована.
Рецензенты:
-
Каменский А.А., д.б.н., профессор, заведущий кафедрой физиологии человека и животных, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, г. Москва;
-
Сапожников А.М., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории клеточных взаимодействий, Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва.
Работа поступила в редакцию 28.04.2012.