Род рододендрон (Rhododendron L.) семейства Вересковые (Ericaceae) насчитывает около тысячи видов вечнозеленых, полулистопадных и листопадных кустарников и деревьев. Кроме того, среди чистых видов встречается большое количество естественных гибридов, а селекционерами создаются гибриды и сорта, несущие признаки, характерные для различных видов. Это создает определенные трудности для определения видовой принадлежности и систематического положения представителей данного рода [5, 10]. В настоящее время в систематике для определения видов наряду с морфологическими и анатомическими признаками используются и данные биохимических и генетических исследований, хотя доля последних все еще несоизмеримо мала [10]. Неоспоримая ценность такого подхода обусловлена требованиями современной науки к разработке естественной классификации, отражающей не только формовое разнообразие, но и эволюционно-таксономические взаимоотношения видов внутри рода Rhododendron.
Генетическая паспортизация представляет собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью морфологических или молекулярных маркеров. Описание морфологических характеристик селекционного материала - элемент классического генетического анализа и селекционного скрининга, его можно считать первым этапом генетической паспортизации [4]. Второй этап связан с разработкой и использованием биохимических и молекулярно-генетических маркеров.
На сегодняшний день проведение генетической паспортизации считается актуальной задачей современной селекции. В мировой практике для паспортизации пород и индивидуальной паспортизации объектов лесного и сельского хозяйства используют преимущественно ДНК-маркеры. Это ядерные элементы, в основном микросателлиты, так называемые STR-маркеры или последовательности ДНК, ограниченные инвертированными повторами.
Молекулярно-генетический анализ имеет ряд существенных преимуществ перед морфофизиологическим. Применение данного метода является актуальным для:
1) оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений, с учетом показателей генетического разнообразия, установленных по результатам молекулярного маркирования множественных геномных участков, а также с обязательным учетом уровней внутри- и межпопуляционного разнообразия;
2) сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений с возможностью проведения отбора в природных условиях популяций и их групп как с наиболее типичными, так и со специфичными характеристиками генофондов;
3) молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация генофондов редких и исчезающих видов растений необходима для оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне, позволяющая на основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК составить молекулярно-генетическую формулу, штрих-код популяций и обобщить данные в виде генетического паспорта [4].
Среди молекулярных маркеров, имеющих множественную локализацию в геноме, наиболее распространёнными являются RAPD-маркеры (RAPD-ПЦР - случайно амплифицированная полиморфная ДНК). Методика ПЦР позволяет амплифицировать ДНК из любой части генома, в том числе фрагменты ДНК с неизвестной (анонимной) нуклеотидной последовательностью [11].
Цель исследования. В рамках комплексного подхода к решению проблемы систематизации представителей рода Rhododendron начата работа, целью которой стало молекулярно-генетическое маркирование с использованием RAPD-метода коллекции рододендронов Ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского государственного университета.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования служили свежие листья 8 видов растений рода рододендрон: Rh. smirnovii, Rh. catawbiense, Rh. brachycarpum, Rh. quinquefolium, Rh. albrechtii, Rh. japonicum,
Rh. dauricum, Rh. thomsonii.
Начальным этапом данного исследования явилось получение препаратов нуклеиновых кислот (ДНК). Как оказалось, при выделении ДНК из разных объектов необходимо учитывать их физиологические и биохимические особенности и, в соответствии с полученными данными, адаптировать уже известные методы выделения ДНК путем внесения в них необходимых модификаций.
Выделение ДНК проводили по модифицированной методике с использованием в качестве детергента ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид). Качество и количество полученных препаратов определяли спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-102, а также при помощи электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.
Реакцию ПЦР проводили с использованием RAPD-праймеров (декануклеотидные праймеры к инвертированным повторам) в амплификаторе «Терцик» в течение 2 часов. Для ПЦР была использована реакционная смесь следующего состава: 2,5 мкл 10*ПЦР буфера (100 мМ Трис-НCl; рН 8,8; 500 мМ КСl), 25 мМ MgCl2, смесь 10 мМ нуклеотидтрифосфатов, 10 мМ праймера, 1 ед. Taq ДНК-полимераза и 1 мкл ДНК (20 нг/мкл).
Для ПЦР применялись следующие RAPD-праймеры: Oligo 1, Oligo 2, Oligo 4, Oligo 6, Oligo 12 и Oligo 29. Температуру отжига для каждого из праймеров подбирали в компьютерной программе OLIGO 6. На следующем этапе выполняли электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 2% агарозном геле с 1х ТАЕ-буфером при 120 Вт в течение 2 ч, длина пробега 5-7 см. Готовый гель окрашивали бромистым этидием, фрагменты ДНК анализировали в трансиллюминаторе Vilber Lourmat. Размеры полученных ампликонов определяли с использованием программного обеспечения Gel Imager-2.
Результаты исследования и их обсуждение
Для выявления индивидуальных различий в структуре ДНК и составления их генетических паспортов для каждого вида рододендронов была проведена ПЦР с каждым из 6 RAPD-праймеров, которые фланкировали участки ДНК, ограниченные инвертированными повторами. На основании полученных спектров ампликонов были составлены таблицы, отражающие наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для каждого из праймеров (наличие ампликона обозначалось цифрой 1, отсутствие цифрой 0) (табл. 1-6).
Таблица 1
Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного
для праймера Oligo 2, у восьми видов рододендронов
|
Ампликон п.н.
Вид |
1930 |
1630 |
1470 |
1050 |
880 |
770 |
690 |
625 |
590 |
500 |
430 |
390 |
370 |
280 |
220 |
200 |
|
Rh. smirnovii |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
|
Rh. catawbiense |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
|
Rh. brachycarpum |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. quinquefolium |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
|
Rh. japonicum |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
|
Rh. albrechtii |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
|
Rh. dauricum |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
|
Rh. thomsonii |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
Таблица 2
Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 12 праймера, у шести видов рододендронов
|
Ампликон п.н.
Вид |
2800 |
1400 |
1230 |
1070 |
925 |
800 |
730 |
690 |
600 |
500 |
470 |
360 |
330 |
300 |
280 |
240 |
210 |
|
Rh. smirnovii |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. atawbiense |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
|
Rh. brachycarpumный |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
|
Rh. quinquefolium |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. japonicum |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
|
Rh. albrechtii |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. dauricum |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
|
Rh. thomsonii |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Таблица 3
Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 6 праймера, у восьми видов рододендронов
|
Ампликон п.н.
Вид |
1620 |
1190 |
1060 |
920 |
800 |
700 |
600 |
550 |
510 |
450 |
410 |
380 |
320 |
280 |
240 |
220 |
130 |
170 |
|
Rh. smirnovii |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
|
Rh. catawbiense |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
|
Rh. brachycarpumй |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
|
Rh. quinquefolium |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. japonicum |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. albrechtii |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
|
Rh. dauricum |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
|
Rh. thomsonii |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
Таблица 4
Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 4 праймера, у восьми видов рододендронов
|
Ампликон п.н.
Вид |
2000 |
1640 |
1400 |
1160 |
1000 |
900 |
800 |
700 |
650 |
600 |
535 |
480 |
420 |
390 |
340 |
300 |
250 |
200 |
|
Rh. smirnovii |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
|
Rh. catawbiense |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
|
Rh brachycarpum |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
|
Rh quinquefolium |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. japonicum |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. albrechtii |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. dauricum |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
|
Rh. thomsonii |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
Таблица 5
Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 1 праймера, у восьми видов рододендронов
|
Ампликон п.н.
Вид |
2000 |
1800 |
1580 |
1370 |
1200 |
1000 |
930 |
870 |
690 |
610 |
560 |
500 |
445 |
380 |
300 |
260 |
240 |
210 |
|
Rh. smirnovii |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
|
Rh. catawbiense |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
|
Rh. brachycarpumный |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
|
Rh. quinquefolium |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
|
Rh. japonicum |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. albrechtii |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. dauricum |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
|
Rh. thomsonii |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
Таблица 6
Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для Oligo 29 праймера, у восьми видов рододендронов.
|
Ампликон п.н.
Вид |
2400 |
1850 |
1640 |
1330 |
1150 |
970 |
830 |
650 |
600 |
560 |
530 |
500 |
470 |
415 |
380 |
300 |
240 |
|
Rh. smirnovii |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. catawbiense |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
|
Rh. brachycarpumный |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
|
Rh. quinquefolium |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. japonicum |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
Rh. albrechtii |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
|
Rh. dauricum |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
|
Rh. thomsonii |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
Из анализа представленных в таблицах данных можно сделать заключение о том, что использованные в работе RAPD-праймеры (Oligo 1, Oligo 2, Oligo 4, Oligo 6, Oligo 12, Oligo 29) позволили получить для каждого образца спектр ампликонов и показали высокую информативность и стабильность. Число амплифицированных фрагментов ДНК варьировалось в зависимости от праймера от 16 (праймер Oligo 2) до 18 (праймер Oligo 4, Oligo 6, Oligo 1), а их размеры - от 170 до 2800 п.н. В среднем при RAPD-анализе у рододендрона один праймер инициировал синтез 18,16 фрагмента ДНК. Общее количество локусов амплификации для каждого праймера по 8 видам составило 104.
Последующий анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что генотипы 8 изученных видов рододендронов, несмотря на сходство между собой, имеют ряд индивидуальных отличий. Идентичность генотипов составила от 23,53% (Rh. smirnovii и Rh. dauricum) до 88,9% (Rh. dauricum и Rh. thomsonii).
Полученные усреднённые данные по сходству последовательностей ДНК (в%) для каждого вида приведены в табл. 7. Из анализа указанной таблицы следует, что наибольшее сходство в структуре ДНК имеют виды Rh. thomsonii и Rh. dauricum, последовательность их ДНК схожа на 74,31%. Наименьшее сходство в последовательности ДНК имеют виды Rh. smirnovii и Rh. dauricum, Rh. brachycarpum и Rh. dauricum. Их ДНК схожа на 48,62%. Внутривидовые различия структуры ДНК у 8 видов рододендрона составили в среднем 6,3%, что говорит о том, что каждая из изученных выборок рододендронов действительно состояла из образцов одного вида.
Таблица 7
Сходство последовательностей ДНК (среднее по 6 праймерам) у изученных видов рододендронов
|
|
Rh. smirnovii |
|
|
|
|
|
|
|
|
Rh. smirnovii |
100 |
Rh. catawbiense |
|
|
|
|
|
|
|
Rh. catawbiense |
63,30 |
100 |
Rh. brachycarpum |
|
|
|
|
|
|
Rh. brachycarpum |
54,18 |
67,89 |
100 |
Rh. quinquefolium |
|
|
|
|
|
Rh. quinquefolium |
56,88 |
53,21 |
54,13 |
100 |
Rh. japonicum |
|
|
|
|
Rh. japonicum |
56,88 |
57,8 |
49,54 |
62,39 |
100 |
Rh. albrechtii |
|
|
|
Rh. albrechtii |
56,88 |
60,55 |
57,8 |
59,63 |
60,55 |
100 |
Rh. dauricum |
|
|
Rh. dauricum |
48,62 |
49,54 |
48,62 |
59,63 |
51,38 |
57,8 |
100 |
Rh. thomsonii |
|
Rh. thomsonii |
57,8 |
52,29 |
52,29 |
61,48 |
60,55 |
54,13 |
74,31 |
100 |
Таким образом, применение шести RAPD-праймеров позволило нам обнаружить различия в структуре ДНК рододендронов разных видов, что дает возможность для составления индивидуальных генетических паспортов с целью их систематизации.
Заключение
В результате проведенного исследования с использованием в полимеразной цепной реакции RAPD-праймеров Oligo 1, Oligo 2, Oligo 4, Oligo 6, Oligo 12, Oligo 29 в спектрах ампликонов у 8 видов рододендронов выявили индивидуальные различия, связанные с присутствием/отсутствием отдельных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами терминальных участков ретротранспозонов. Эти различия свидетельствуют о сложности процессов возникновения генетической изменчивости.
Таким образом, на большом фактическом материале убедительно доказано, что для оценки генетического разнообразия и паспортизации видов рододендронов подходящим является использование ДНК-анализа на основе ПЦР с использованием RAPD-праймеров. Однако для более полной молекулярно-генетической характеристики необходимо применение комплексного подхода, включающего и другие методы на основе ПЦР, позволяющие получить достоверную и объективную информацию для целей идентификации и сохранения генетического материала коллекции рододендронов ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского государственного университета.
Данная работа выполнена в рамках и при поддержке государственного контракта на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ федеральной целевой программы Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы № 16.518.11.7099 Оценка состояния растительных ресурсов при интродукции в Центрально-Черноземном регионе и разработка мероприятий по их сохранению на базе ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета
Рецензенты:
-
Дурнова Н.А., д.б.н., доцент, зав. кафедрой общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Саратов;
-
Полуконова Н.В., д.б.н., профессор кафедры общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 06.04.2012.