Эхинацея узколистная (Echinacea angustifolia D.C.) относится к семейству астровых (Asteraceae Dumort.). Род Echinacea по различным данным, включает в себя от пяти до девяти видов, такие как эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea (L.) Moench), эхинацея странная (Echinacea paradoxa Britton), эхинацея бледная (Echinacea pallida Nutt) и эхинацея узколистная (Echinacea angustifolia D.C.). Название растения произошло от греческого слова echinos - колючий [5]. Эхинацея относится к лекарственным растениям, поддерживающим иммунный статус организма, то есть к неспецифическим иммуномодуляторам. Ее препараты применяют при простудах, зубной боли, укусах змей, бешенстве, раневых инфекциях и многих других, причем для медицинских целей используют растения, начиная с двухлетнего возраста. На основе эхинацеи пурпурной и эхинацеи странной (единственный вид в роде с желтыми цветками) выведены многие сорта и гибриды, соединившие в себе лучшие черты своих родителей - крупные соцветия, великолепную окраску и приятный аромат. Помимо традиционной розово-малиновой гаммы, селекционные эхинацеи бывают оранжевыми, желтыми и белыми. Некоторые сорта обладают душистыми цветками, поникающими, махровыми, с возвышающимися венчиками.
В случае семенного размножения основных видов эхинацеи потомство сохраняет признаки родительских форм, но гибридные растения могут размножаться только вегетативно, делением куста. В связи с высокой ценностью и декоративностью видов, а также обнаружения все большего медицинского потенциала растения возникает потребность в производстве его плантационных количеств. Этого можно достичь только с помощью микроклонального тиражирования, т.е. размножения в условиях in vitro. Публикации на эту тему удалось найти только в иностранной печати, причем исследователи при размножении разных видов эхинацеи использовали питательные среды, дополненные сочетанием нескольких гормонов [1, 6].
Целью настоящей работы была разработка метода микроклонального размножения эхинацеи в культуре ткани на примере эхинацеи узколистной.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования были использованы растения эхинацеи узколистной, произрастающие на территории ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета. Для введения в культуру ткани использовали как семена, так и молодые листья.
Стерилизацию семян производили с предварительным отмыванием в течение 20 мин в проточной воде в мешочках из фильтровальной бумаги. Затем выдерживали в растворе коммерческого отбеливателя «Белизна» в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:3, соответственно. После этого семена помещали в 70%-й этанол на 30 с. Затем семена трижды промывали дистиллированной стерильной водой и помещали на поверхность безгормональной питательной среды Мурасиге и Скуга (МС) [4].
Стерилизацию листьев производили по удлиненной схеме. После протирания листьев мыльным раствором, их помещали на 10 мин в раствор жидкого моющего средства «Зеленое яблоко», сходного по действию с дорогостоящим препаратом Tween, затем осуществляли отмывание от поверхностной сапрофитной микрофлоры проточной водой (20 мин). Собственно стерилизация проходила в течение 15 мин в растворе, содержащим смесь 0,015% мертиолята и 4% «Белизны», с последующим троекратным отмыванием в стерильной дистиллированной воде (по 5 мин). Стерильные листья (высечки 2×2 см) помещали на поверхность среды Мурасиге и Скуга, дополненной 6-бензиламинопурином (БАП) в концентрации 1 мг/л.
Питательные среды были доведены до рН 5,6-5,8 и автоклавированы при 121°С и 1 атмосферы в течение 20 мин с предварительной продувкой горячим паром (20 мин). В качестве культивационных сосудов использовали пенициллиновые пузырьки (семена), а также пластиковые контейнеры для культуры ткани Magenta Box, ASCO.
Результаты исследования и их обсуждение
Размножается эхинацея семенами и вегетативно - делением корневища ранней весной или поздней осенью. Семена не нуждаются в стратификации, но всходят очень долго - до 40 дней, причем им требуется достаточно влаги и тепла. У эхинацеи узколистной в разные годы наблюдается большой разброс между потенциальной и реальной семенной продуктивностью. Так, в 2011 году коэффициент семенификации составил 5%. На рис. 1 показано прорастание семени эхинацеи узколистной.
Рис. 1. Прорастание семени в культуре in vitro (слева) и укоренившийся проросток семени (справа) эхинацеи узколистной на безгормональной среде Мурасиге и Скуга
Вторым способом микроклонального размножения эхинацеи in vitro было использование высечек листьев, когда часть стерильного листа, сохраняющего главное жилкование, кладется на поверхность или помещается слегка наклонно по отношению к питательной среде. В этом случае используется базовая среда Мурасиге и Скуга, дополненная 1 мг/л 6-бензиламинопурином. Через некоторое время (около 2 недель инкубирования) на базальной части экспланта начинается образование каллуса. При переносе таких растений на безгормональные среды начинается спонтанный ризогенез (рис. 2).
Рис. 2. Образование ризогенного каллуса (слева) и корней (справа) на листовых высечках эхинацеи узколистной
В течение двух-трех последующих недель у основания появляются адвентивные побеги, при изолировании и пересадке которых на безгормональные среды процесс ризогенеза продолжается одновременно с вытягиванием растений, что показано на рис. 3. Использование для укоренения сред, содержащих индолилмасляную или индолилуксусную кислоты (0,5-3,0 мг/л), а также активированного угля (1%) не приводило к ускорению процесса регенерации.
Рис. 3. Мультипликация побегов эхинацеи узколистной на безгормональной среде Мурасиге и Скуга
Таким образом, в настоящем исследовании были разработаны условия регенерации, роста и образования корней у эхинацеи узколистной из двух типов эксплантов: семян и листовых высечек. Коэффициент мультипликации достигал 7,5 на одно растение. Другие авторы для микроклонального размножения эхинацеи использовали стеблевые сегменты, а в среды при укоренении добавляли активированный уголь [2, 3, 7]. Для размножения эхинацеи рядом исследователей использовался метод соматического эмбриогенеза [2, 7]. Соматический эмбриогенез является, на наш взгляд, дорогостоящим и долговременным методом, при этом растения могут обладать полезной сомаклональной изменчивостью. С другой стороны, мутантные растения можно получить и другими методами, например, размножением в присутствии 2,4-Д.
В случае эхинацеи достаточно традиционных способов культивирования in vitro. В некоторых статьях отмечается контаминация семян системными грибами [3], однако в нашем случае подобного явления не наблюдалось. В общем, можно заключить, что культивирование эхинацеи в культуре ткани легко достижимо при использовании листовых высечек и семян в осеннее время или по типу размножения древесных растений в культуре стеблевых эксплантов, используя пазушные почки высоких побегов, летом в период цветения.
Работа выполнена в рамках и при поддержке государственного контракта на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» № 16.518.11.7099.
Рецензенты:
-
Свистова И.Д., д.б.н., профессор кафедры биологии растений и животных естественно-географического факультета ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет», г. Воронеж;
-
Мелькумова Е.А., д.б.н., профессор кафедры ботаники, защиты растений, биохимии, микробиологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I», г. Воронеж.
Работа поступила в редакцию 06.04.2012.