Острый панкреатит (ОП) - одна из наиболее сложных ургентных хирургических патологий в диагностическом и лечебном плане. Это обусловлено целым рядом причин, в том числе и отсутствием общего мнения в отношении патогенетических механизмов развития различных форм этого заболевания [7]. При этом существующие в настоящее время взгляды на патогенез ОП недостаточны для установления различий в клинической картине острого билиарного (ОБП) и небилиарного панкреатита
(ОНБП) [5]. Многие экспериментальные и клинические работы по оценке иммунного статуса при ОП свидетельствуют о развитии вторичного иммунодефицита, который служит основой для поздних гнойных осложнений ОП [1]. Кроме того, большой интерес представляет изучение эритроцитзависимых механизмов развития иммуносупрессии при различных патологических состояниях, в том числе и при ОП [3].
Известно, что эритроциты, помимо осуществления газотранспортной функции, принимают участие в регуляции кислотно-основного состояния и водно-солевого обмена, определяют микрореологические свойства крови и функции иммунокомпетентных клеток и т.д. [6]. Более того, степень и характер структурно-функциональных нарушений эритроцитов зависят от тяжести ОП [2]. Однако в зависимости от этиологии оценка изменений структурно-функциональных свойств эритроцитов не проводилась.
Исходя из этого, целью работы стала оценка изменений представительности белков и липидов мембраны эритроцитов у больных острым билиарным и небилиарным панкреатитом на фоне лечения.
Материалы и методы исследования
Под постоянным наблюдением на основании информированного согласия находилось 37 пациентов с ОБП и 35 больных с ОНБП, проходивших лечение в стационарне в МУЗ «Городская клиническая больница №4» г. Курска с 2007 по 2010 г. В качестве контроля исследовали периферическую кровь 16 здоровых доноров добровольцев.
Критериями включения в исследование были: возраст от 24 до 50 лет, верифицированный диагноз ОБП или ОНБП, лица, поступающие в стационар впервые и не подвергавшиеся ранее оперативному вмешательству, наличие сопутствующей патологии в стадии ремиссии, переносимость использованных в исследовании фармакологических препаратов, письменное согласие на участие в проводимых исследованиях. Все пациенты получали следующее лечение: инфузионная терапия со спазмолитиками и анальгетиками; антиферментные препараты - «Гордокс», «Контрикал»; антибактериальная терапия препаратами широкого спектра действия, антисекреторная терапия.
Лабораторные методы исследования крови проводились по общепринятым методикам при поступлении больных в стационар и на 15-е сутки. При оценке гемограмм за основу брались физиологические нормы, соответствующие международной системе единиц в клинических исследованиях.
Эритроциты получали из 5 мл гепаринизированной крови. Определяли сорбционную способность эритроцитов (ССЭ) [9] и сорбционную емкость их гликокаликса (СЕГ) [8]. О функциональном состоянии эритроцитов судили также по накоплению малонового диальдегида (МДА).
Мембраны эритроцитов получали методом G.T. Dodge (1963). Электрофорез проводили в присутствии додецилсульфата натрия в вертикальных пластинах полиакриламидного геля по методу U.K. Laemmli (1970). Белки окрашивали кумаси голубым R-250 по модифицированной методике G. Fairbanks (1971). Липиды выделяли методом тонкослойной хроматографии [4].
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя средние арифметические и стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Манна.
Результаты исследования и их обсуждение
До лечения у больных ОБП выявлено снижение представительности в мембране эритроцитов подфракций спектрина (α и β), анкирина, анионтранспортного белка, белка полосы 4.5 и повышение - белка полосы 4.1, паллидина, дематина, актина, тропомиозина, СЕГ, ССЭ и внутриклеточной концентрации МДА (табл. 1). У пациентов с ОНБП в отличие от предыдущей группы в большей степени снижена представительность α- и β-спектрина, анкирина, АТБ, достоверно выше уровень белка полосы 4.1, паллидина, дематина, актина и концентрация внутриклеточного МДА (табл. 1).
Таблица 1
Изменение представительности белков и сорбционных показателей у больных с различной этиологией острого панкреатита на фоне традиционного лечения (M ± m)
|
Показатели |
Единицы измерения |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Больные ОП |
||||||
|
Здоровые |
ОБП |
ОНБП |
ОБП после |
ОНБП после |
||
|
α-спектрин (1α) |
мг % |
114,3 ± 8,01 |
98,4 ± 5,1*1 |
83,1 ± 3,6*1,2 |
122,8 ± 5,3*2,3 |
99,6 ± 7,8*1,3,4 |
|
β-спектрин (1β) |
мг % |
106,6 ± 7,62 |
81,9 ± 4,8*1 |
68,8 ± 3,6*1,2 |
92,3 ± 6,9*1-3 |
70,6 ± 12,7*1,2,4 |
|
Анкирин (2) |
мг % |
113,3 ± 8,92 |
92,7 ± 3,8*1 |
30,6 ± 5,5*1,2 |
113,3 ± 3,7*2,3 |
39,9 ± 5,1*1,2,4 |
|
Анионтранспортный белок (3) |
мг % |
189,6 ± 9,4 |
166,9 ± 8,8*1 |
138,7 ± 3,9*1,2 |
178,2 ± 2,8*1,3 |
159,7 ± 9,5*1,3,4 |
|
Белок полосы 4.1 (4.1) |
мг % |
43,3 ± 4,12 |
56,6 ± 2,7*1 |
75,5 ± 4,1*1,2 |
46,8 ± 8,7*2,3 |
68,1 ± 8,9*1,4 |
|
Паллидин (4.2) |
мг % |
56,6 ± 3,91 |
70,6 ± 4,2*1 |
92,8 ± 5,8*1,2 |
71,9 ± 5,8*1,3 |
68,4 ± 7,1*1,3 |
|
Белок полосы 4.5 (4.5) |
мг % |
98,2 ± 7,45 |
73,6 ± 5,7*1 |
71,9 ± 2,5*1 |
92,9 ± 7,2*2,3 |
64,6 ± 9,2*1-4 |
|
Дематин (4.9) |
мг % |
20,1 ± 2,12 |
45,6 ± 2,1*1 |
64,9 ± 3,1*1,2 |
35,8 ± 3,7*1-3 |
72,9 ± 7,3*1,2,4 |
|
Актин (5) |
мг % |
102,1 ± 8,94 |
124,5 ± 7,8*1 |
168,2 ± 6,1*1,2 |
129,1 ± 10,4*1,3 |
159,0 ± 17,1*1,2,4 |
|
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (6) |
мг % |
37,8 ± 2,61 |
36,1 ± 2,8 |
22,6 ± 1,1*1,2 |
34,9 ± 7,3*3 |
27,8 ± 3,2*1,2,4 |
|
Тропомиозин (7) |
мг % |
68,8 ± 4,63 |
88,9 ± 4,1*1 |
92,7 ± 5,1*1 |
78,1 ± 5,9*1,2 |
73,8 ± 12,5*2-4 |
|
Глутатион-S-трансфераза (8) |
мг % |
49,3 ± 4,12 |
50,5 ± 2,9 |
41,5 ± 1,8*1,2 |
59,1 ± 6,3*3 |
42,6 ± 3,0*1,2,4 |
|
СЕГ |
10-12 г/эр. |
1,42 ± 0,11 |
1,57 ± 0,11*1 |
1,25 ± 0,05*1,2 |
1,38 ± 0,15*2,3 |
1,44 ± 0,13*2,3 |
|
ССЭ |
% |
32,8 ± 1,23 |
48,4 ± 3,89*1 |
20,5 ± 1,01*1,2 |
39,9 ± 2,7*1-3 |
19,7 ± 1,9*1-4 |
|
МДА |
нмоль·106 эр. |
3,54 ± 0,15 |
5,2 ± 0,28*1 |
6,5 ± 0,38*1,2 |
3,35 ± 0,44*2,3 |
5,67 ± 0,48*1,3,4 |
Примечание: здесь и в табл. 2 звездочкой отмечены достоверные отличия средних арифметических (p < 0,05); цифры рядом со звездочкой - по отношению к показателям какой группы эти данные различны.
При этом у пациентов с ОНБП по сравнению с пациентами с ОБП и со здоровыми донорами снижен уровень глутатион-S-трансферазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, ССЭ и СЕГ (см. табл. 1).
Таким образом, у больных ОБП выявленные изменения свидетельствуют об уменьшении прочности и деформируемости эритроцитарной мембраны, повышении сорбционных показателей и снижении их метаболической активности, что ускоряет процессы старения, тогда как у пациентов с ОНБП данные изменения более выражены, но при этом еще и снижены ССЭ и СЕГ [3, 6].
Основу мембраны эритроцитов образует двойной фосфолипидный слой со встроенными в него белками. Молекулы фосфолипидов определяют и стабилизируют специфическую укладку в мембране полипептидных цепей всех интегральных и некоторых периферических белков, регулируют подвижность и активность внутримембранных транспортных, ферментных и рецепторных белков. Дезорганизация липидов мембраны, являющихся субстратом перекисного окисления и ферментативного гидросидролиза, приводит к нарушению антиоксидантного гомеостаза, снижению активности транспортных и ферментных белков и к необратимым структурно-функциональным изменениям [3].
У пациентов с ОБП при госпитализации выявлено повышение в эритроцитарной мембране уровней свободного холестерина, свободных жирных кислот, триглицеридов, фосфатидилэтаноламина, лизофосфатидилхолина, фосфатидилинозитола и снижение концентрации сфингомиелина и фосфатидилхолина, тогда как у пациентов с ОНБП - снижение уровня моно- и диглицеридов, эфиров холестерина, при нормальном содержании фосфатидилэтаноламина, лизофосфатидилхолина, фосфатидилинозитола, свободного холестерина, при более низком уровне сфингомиелинов (табл. 2).
Таблица 2
Представительность липидов в мембране эритроцитов
до и после традиционного лечения больных с ОБП и ОНБП (M ± m)
|
Показатели |
Единицы |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Больные ОП |
||||||
|
Здоровые |
ОБП |
ОНБП |
ОБП после |
ОНБП после |
||
|
Нейтральные липиды |
||||||
|
Холестерин |
мг % |
47,8 ± 1,4 |
58,2 ± 1,1*1 |
50,9 ± 0,33*2 |
49,8 ± 0,35*2 |
48,7 ± 0,15*2,3 |
|
Эфиры холестерина |
мг % |
46,2 ± 1,62 |
47,0 ± 0,4 |
35,4 ± 0,63*1,2 |
47,6 ± 0,31*3 |
34,7 ± 0,38*1,2,4 |
|
Свободные жирные кислоты |
мг % |
2,98 ± 0,17 |
3,46 ± 0,17*1 |
3,44 ± 0,19*1 |
2,28 ± 0,19*1-3 |
2,86 ± 0,2*2-4 |
|
Моно- и диглицериды |
мг % |
9,6 ± 0,49 |
9,04 ± 0,2 |
7,64 ± 0,42*1,2 |
10,3 ± 0,51*2,3 |
8,83 ± 0,4*3,4 |
|
Триглицериды |
мг % |
14,5 ± 0,67 |
16,9 ± 0,23*1 |
15,1 ± 0,43 |
16,7 ± 0,32*1 |
15,5 ± 0,49*2,4 |
|
Фосфолипиды |
||||||
|
Фосфатидилхолин |
мг % |
23,0 ± 0,7 |
12,4 ± 0,1*1 |
11,5 ± 0,23*1 |
16,7 ± 0,52*1-3 |
11,4 ± 0,36*1,4 |
|
Фосфатидилэтаноламин |
мг % |
23,5 ± 0,97 |
26,0 ± 0,17*1 |
24,6 ± 0,13*2 |
24,0 ± 0,6*2 |
23,8 ± 0,2*2,3 |
|
Лизофосфатидилхолин |
мг % |
5,4 ± 0,17 |
8,6 ± 0,48*1 |
5,57 ± 0,12*2 |
9,28 ± 0,46*1,3 |
4,73 ± 0,18*1-4 |
|
Фосфатидилинозитол |
мг % |
19,7 ± 0,69 |
22,0 ± 0,38*1 |
19,8 ± 0,1*2 |
24,2 ± 0,37*1-3 |
22,0 ± 0,2*1,3 |
|
Сфингомиелин |
мг % |
11,0 ± 0,52 |
9,6 ± 0,22*1 |
8,97 ± 0,1*1,2 |
10,6 ± 0,11*2,3 |
9,1 ± 0,46*1,4 |
Таким образом, у больных ОБН и ОНБП в мембране эритроцитов также выявлены различные изменения в липидном спектре, что, в свою очередь, сказывается и на организации мембраны в целом. Так, повышенный уровень холестерина уменьшает подвижность жирных кислот, снижает латеральную диффузию липидов и белков, изменяет функцию последних.
Снижение сфингимиелина обусловливает снижение микровязкости липидной фазы мембраны, тогда как низкий уровень фосфатидилхолина снижает проницаемость мембраны и уменьшает метаболизм холестерина, что приводит к насыщению им мембран эритроцитов, снижает латеральную диффузию липидов и белков, тем самым повышая сорбционные свойств всей мембраны (ССЭ и СЕГ), что наблюдается при ОБП, так как эта форма ОП сопровождается экстренностью («внезапностью») патологии, так как ОП обусловлен в первую очередь холедохолитиазом и/или блоком большого сосочка двенадцатиперстной кишки камнем [5]. У пациентов с ОНБП, в отличие от предыдущей группы, уровень фосфолипидов остается на уровне нормы, но снижение концентрации эфиров холестерина, эфиров жирных кислот и моно- и диглицеридов свидетельствует об активации липолитических процессов, что связано со старением эритроцитов и угнетением их основной функции - газотранспортной [3, 10]. Эти изменения имеют непосредственную связь с анамнезом заболевания. Длительный прием алкоголя, жирной и/или острой пищи, токсинов и др., вызывает развитие хронического повышения процессов перекисного окисления липидов, как внутри клетки, так и в ее мембране, что вызывает увеличение внутриклеточного содержания МДА и приводит к «вымыванию» холестерина из фосфолипидного слоя эритроцитарной мембраны, уменьшению ее липидной части за счет эфиров холестерина, моно- и диглицеридов, поэтому при достижении некоторого критического уровня белково-липидного соотношения в эритроцитарной мембране происходит потеря периферических и частично интегрированных белков, что и приводит к снижению ССЭ и СЕГ [10].
Проведенное традиционное лечение у пациентов с ОБП позволило нормализовать в мембране эритроцитов уровень анкирина, белка полосы 4.1, 4.5, СЕГ и концентрацию внутри клеток МДА, тогда как у пациентов с ОНБП нормализовало достоверно меньшее количество показателей белкового спектра - уровень тропомиозина и СЕГ (см. табл. 1). При исследовании изменения представительности липидного спектра в мембране эритроцитов у пациентов с ОБП на фоне лечения установлена нормализация в мембране красных клеток крови количества холестерина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина и корригирующие эффекты его на уровень свободных жирных кислот и изученных фосфолипидов. У больных с ОНБП в мембране красных клеток крови нормализовался уровень свободных жирных кислот, моно- и диглицеридов (см. табл. 2).
Таким образом, у больных ОП выявлены изменения представительности в белковом и липидном спектре мембран эритроцитов, более выраженные и несколько отличные у пациентов с ОНБП, по сравнению с больными с ОБП, при этом у пациентов с ОБП эффективность традиционной комплексной терапии в коррекции структурно-функциональных свойств мембраны эритроцитов гораздо выше, чем у пациентов с ОНБП. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли структурно-функциональных свойств красных клеток крови в патогенезе ОП и необходимости коррекции при данной патологии, особенно при ОНБП, представительности белков и липидов в эритроцитарной мембране с использованием дополнительных способов фармакологического воздействия: использования мембранопротекторов и антиоксидантов.
Рецензенты:
Быстрова Н.А., д.м.н., профессор кафедры биохимии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет», Минздравсоцразвития РФ, г. Курск;
Афанасьев Ю.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой внутренних болезней №1 ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки РФ, г. Белгород.
Работа поступила в редакцию 18.10.2011.