В последние годы наблюдается появление совершенно новых технологий, которые кардинально меняют наше понимание структуры и функции живой системы. Эти технологии не только пополняют наши знания о живой системе, но и позволяют регулировать ее функционирование, что очень важно с позиций коррекции нарушенных функций. Одними из таких технологий являются клеточные технологии. Под клеточными технологиями в настоящее время понимают применение стволовых клеток для восстановления структурно измененных частей ткани, для замещения некротизированных участков различных тканей нормальными клетками этих же тканей. Однако если учесть, что в основе этих технологий все же лежит использование клеток, то применение других, дифференцированных клеток для аналогичных целей, или же для моделирования различных состояний и коррекции определенных нарушений также можно отнести к клеточным технологиям.
В этом плане особый интерес представляют адоптированные лимфоциты. В настоящее время показано, что с помощью адоптированных лимфоцитов можно переносить информацию о регенерации, о хроническом токсическом гепатите, нефрозонефрите, панкреатите, гипертрофии миокарда и почек, остеопетрозе и стрессе [1]. Несмотря на доказанность факта переноса адоптированными лимфоцитами информации о функциональном состоянии одного организма другому, механизмы данного явления все же остаются нераскрытыми. A priori можно предполагать зависимость адоптивной функции лимфоцитов от структурной целостности их мембран. В то же время известно, что активация свободнорадикального процесса в биологических мембранах приводит к нарушению целостности всей клеточной системы [3].
Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилась оценка влияния интенсификации свободнорадикального окисления липидов лимфоцитов на их адоптивные возможности.
Материал и методы исследования
Исследования были проведены на 193 белых беспородных мышах-самцах, массой 16-23 г.
Критерием, позволяющим оценить степень переноса информации о функциональном состоянии организма с помощью лимфоидных клеток, считали функционально активное и ингибированное состояние монооксигеназной системы (МОС) печени. Для получения функционально активного состояния МОС был введен индуктор - бензонал, а для получения функционально пассивного состояния - ингибитор CoCl2. Бензонал вводили мышам в дозе 50 мг/кг массы тела на крахмальном клейстере, перорально в течение 3 дней [5]. CoCl2 вводили мышам в виде водного раствора в дозе 15 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно 1 раз [5].
После моделирования различных функциональных состояний МОС животные забивались под эфирным наркозом. Выделяли общую популяцию лимфоцитов из лимфатических узлов брыжейки, которые в количестве 5 млн на мышь вводились интактным животным. Через день после введения лимфоцитов изучалась длительность гексеналового сна, которая характеризует in vivo состояние МОС печени. Гексенал животным вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг массы тела [5].
Для исследования роли целостности мембран адоптированных лимфоцитов в осуществлении переноса информации о функциональном состоянии МОС, у мышей вызвали ее индукцию и ингибирование, после чего животных забили и выделяли общую популяцию лимфоцитов из лимфатических узлов брыжейки. Схема эксперимента приведена на рис. 1.
Рис. 1. Схема эксперимента по изменению компонентов мембран лимфоцитов путем активации свободнорадикального окисления липидов
Суспензию лимфоцитов разделяли на 3 части. К первой добавляли 2 мМ Fe2+ (прооксидант) в объеме 0,02 мл (опыт), во вторую - дистиллированную воду в том же объеме (контроль), а третью часть оставляли без изменений (интакт). Первую и вторую пробирку с суспензиями лимфоцитов, инкубировали в водяном термостате в течение 30 минут при 37 ºС. После инкубации из всех пробирок брали по 0,2 мл суспензии для определения содержания продуктов свободнорадикального окисления липидов (СРОЛ). Остальные лимфоциты были введены интактным мышам в количестве 5 млн на мышь. Через день после введения лимфоцитов изучалась длительность гексеналового сна.
Состояние процесса СРОЛ оценивали по содержанию диеновых (ДК), триеновых конъюгатов (ТК) и по индексу окисленности (ИО) липидов. Содержание ДК и ТК в сыворотке крови определяли по методу В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной (1983) [4]. Принцип метода заключается в экстракции ДК и ТК смесью гептан-изопропанола в кислой среде с последующим измерением оптической плотности при длине волны 233 и 278 нм на спектрофотометре (В работе был использован двухволновой спектрофотометр «Hitachi-330», Япония). Содержание ДК и ТК рассчитывали в относительных единицах на мл суспензии (Е/мл) лимфоцитов. Степень ИО липидов определяли по соотношению продуктов, поглощающих УФ-излучение на разной длине волн, т.е. по отношению 232/215 нм, где 215 нм - это максимум поглощения ненасыщенных липидов [2].
Результаты подвергали статистической обработки с применением критерия t Стъюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
Проведенные исследования показали, что при введении общей популяции лимфоцитов, выделенных из контрольных мышей (получавшие крахмальный клейстер без индуктора МОС), к интактным животным длительность гексеналового сна равнялась 31,90 ± 1,19 мин. При этом мыши без экспериментального вмешательства пребывали в наркотическом сне 30,85 ± 0,52 мин. При введении общей популяции лимфоцитов, выделенных из животных с индуцированной МОС к интактным мышам, длительность гексеналового сна равнялась 23,70 ± 0,59 мин. Следовательно, при введении интактным животным общей популяции лимфоцитов, выделенной из животных с индуцированной МОС, наблюдается статистически значимое укорочение длительности гексеналового сна на 25,7 и 23,2 % по сравнению с контролем и нормой соответственно.
При введении общей популяции лимфоцитов, выделенных из контрольных мышей (получавшие соответствующий объем дистиллированной воды без ингибитора МОС печени), к интактным животным длительность гексеналового сна равнялась 31,00 ± 0,65 мин. При введении общей популяции лимфоцитов, выделенных из животных с ингибированной МОС печени к интактным, длительность гексеналового сна равнялась 53,8 ± 3,0 мин. Следовательно, при введении интактным животным общей популяции лимфоцитов, выделенной из животных с ингибированной МОС, наблюдается статистически значимое удлинение длительности гексеналового сна на 73,6 и 74,4 % по сравнению с контролем и нормой соответственно.
Таким образом, результаты свидетельствуют, что с помощью адоптированных лимфоцитов можно перенести информацию о функциональном (индуцированном или ингибированном) состоянии МОС печени из одного организма в другой. При этом возникает вопрос: влияет ли целостность клеточной мембраны на процесс переноса информации?
Для ответа на этот вопрос, полученную из мышей с индуцированной и ингибированной МОС печени, общую популяцию лимфоцитов разделяли на 3 части. В первую часть добавляли прооксидант (Fe2+), во вторую - соответствующий объем воды (контроль), а третью оставляли без вмешательства (интакт). Через 30 мин инкубации при 37 ºС в пробах изучали содержание продуктов ПОЛ.
Результаты исследований показали, что в первой части лимфоцитов, выделенной из индуцированной МОС печени, содержание ДК равнялось 0,8 ± 0,04 Е/мл, тогда как во второй и третьей частях оно было равно 0,25 ± 0,02 и 0,20 ± 0,01 Е/мл соответственно (рис. 2,а). При этом содержание ТК в первой части равнялось 0,47 ± 0,03 Е/мл, а во второй и третьей - 0,12 ± 0,002 и 0,08 ± 0,001 Е/мл соответственно. ИО липидов был равен 0,45 ± 0,03; 0,24 ± 0,02 и 0,22 ± 0,02 соответственно в первой, второй и третьей частях суспензии лимфоцитов.
На основании полученных результатов можно констатировать, что в первой части лимфоцитов наблюдается значительное повышение интенсивности процесса СРОЛ, по сравнению со второй и третьей фракциями лимфоцитов.
Далее эти же лимфоциты были введены интактным мышам и через сутки изучали длительность гексеналового сна. Результаты показали, что у мышей, получавших адоптированные лимфоциты, выделенных от животных с индуцированным СРОЛ, длительность гексеналового сна равняется 28 ± 2,1 минутам, тогда как у мышей, получивших адоптированные лимфоциты без индукции СРОЛ, он равнялся 20,0 ± 1,7 и 19,7 ± 1,5 мин (рис. 2,б).
а
б
Рис. 2. Влияние интенсификации СРОЛ адоптированных лимфоцитов на процесс переноса информации о функционально активном состоянии МОС печени:
а - состояние СРОЛ в 3 фракциях лимфоцитов; б - длительность гексеналового сна у мышей при введении 3 фракции лимфоцитов. * - Р < 0,05 по сравнению со значениями группы без добавки
Следовательно, индукция процесса СРОЛ в лимфоцитах приводит к исчезновению способности переноса ими информации о функционально активном состоянии МОС печени из одного организма в другой.
В случае с ингибированной МОС печени первой части лимфоцитов содержание ДК равнялось 0,85 ± 0,05 Е/мл, тогда как во второй и третьей частях оно было равно 0,22 ± 0,02 и 0,24 ± 0,02 Е/мл соответственно (рис. 3,а).
При этом содержание ТК равнялось 0,50 ± 0,04 Е/мл, а во второй и третьей части оно было равно 0,10 ± 0,004 и 0,09 ± 0,001 Е/мл соответственно. ИО липидов был равно 0,48 ± 0,04; 0,23 ± 0,02 и 0,20 ± 0,01 соответственно в первой, второй и третьей частях суспензии лимфоцитов.
Полученные результаты указывают на значительное повышение интенсивности процесса СРОЛ в первой части лимфоцитов по сравнению со второй и третьей фракциями лимфоцитов.
Проведенный через день гексеналовый тест выявил, что у мышей, получавших адоптированные лимфоциты, выделенных от животных с индуцированным СРОЛ, длительность гексеналового сна равняется 29 ± 2,5 мин, тогда как у мышей, получивших адоптированные лимфоциты без индукции СРОЛ, он равнялся 38,8 ± 2,3 и 37,7 ± 2,5 мин (рис. 3,б). Следовательно, индукция процесса СРОЛ в лимфоцитах приводит к исчезновению способности переноса ими также информацию о пассивном состоянии МОС печени из одного организма в другой.
Таким образом, полученные результаты показали, что введение интактным животным лимфоцитов, выделенных из животных с индуцированной и ингибированной МОС печени, соответственно приводит к индуцированию и ингибированию этой системы у реципиентов. Интенсификация процесса свободнорадикального окисления липидов в мембране лимфоцитов, выделенных из доноров, приводит к утрате ими возможности переноса информации о функциональном состоянии организма. Это наводит на мысль, что перенос информации о функциональном состоянии одного организма к другому, осуществляется целостной клеткой и, скорее всего, происходит на уровне цитоплазматической пограничной мембраны адоптированного лимфоцита.
а
б
Рис. 3. Влияние интенсификации СРОЛ адоптированных лимфоцитов на процесс переноса информации о функционально пассивном состоянии МОС печени
Работа выполнена на основании прикладного научного гранта Республики Узбекистан 31.11 «Создание новых моделей патологических состояний с помощью адоптированных лимфоцитов».
Рецензенты:
Батырбеков А.А., д.м.н., профессор, зам. директора института иммунологии Академии наук Республики Узбекистан, г. Ташкент;
Тухтаев К.Р., д.м.н., профессор , профессор кафедры гистологии и медицинской биологии Ташкентской медицинской академии, г. Ташкент.
Работа поступила в редакцию 25.07.2011.